TLR4对脑缺血再灌注小鼠皮质IRF-3和IFN-β表达的影响

刘姗姗，李静平，高音

（齐齐哈尔医学院 基础医学院解剖学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

干扰素调节因子3（interferon-regulated factor-3，IRF-3）作为一个重要的转录调节因子，在Toll样受体 4（Toll-like receptor 4，TLR4）介导的髓样分化因子 88（myeloid differentiationfactor 88，MyD88）非 依赖信号转导通路（TIR-domain containing adaptor inducing interferon-β，TRIF信号途径）抵抗病原体入侵的免疫应答的启动过程中起着重要作用，IRF-3活化后形成同源二聚体转位入核，诱导β干扰素（interferon β，IFN-β）基因表达［1，2］。目前，对 TLR4介导的TRIF依赖信号通路中IRF-3的研究主要集中在抗感染免疫反应中［3，4］，本研究采用 TLR4 抗体封闭阻断 TLR4，Western blot检测皮质TLR4、IRF-3和IFN-β蛋白表达量，旨在观察脑缺血再灌注损伤是否激活TLR4及采用TLR4抗体阻断TLR4后，IRF-3和IFN-β的表达变化，探讨TLR4参与脑缺血再灌注的反应机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

兔抗TLR4单克隆抗体（sc-16240）、辣根过氧化物酶标记羊抗兔、羊抗羊IgG二抗、β-actin抗体、兔抗IRF-3单克隆抗体（sc-9082）、山羊抗IFN-β单克隆抗体 IgG（sc-17569）（美国 Santa Cruz公司）。

1.2 实验动物的分组

健康昆明种小鼠144只，雌雄兼用，体质量18~22 g，由中国医科大学实验动物中心提供，随机分为3 组：（1）假手术组（S 组，n=48）；（2）缺血再灌注组（I组，n=48）；（3）TLR4 阻断组（T 组，n=48）。各组又分 1 d、2 d、3 d、4 d 4 个时间点组（n=6）。

1.3 小鼠脑缺血再灌注模型的制备

手术在室温25℃、湿度50%的条件下进行。用2%的戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg），络合碘消毒，行颈部正中切口，分离两侧颈总动脉（common carotid arteries，CCA），用动脉夹夹闭小鼠双侧颈总动脉血流，阻断12 min后，松开动脉夹实现再灌注。在阻断双侧颈总动脉血流后，出现心跳加快、呼吸幅度加深、频率先加快、后减慢典型生理变化过程的小鼠，作为缺血成功样本入选。TLR4阻断组小鼠缺血10 min时在右侧颈总动脉内注入TLR4抗体（10 μg/ml）0.1 ml，注射为缓慢注射，用微量注射泵在2 min内注射完毕，缝合切口。缺血再灌注组注射等量生理盐水，假手术组只分离双侧颈总动脉，其余步骤同上。术中用白炽灯保持小鼠肛温在（37±0.5）℃。术后置清洁饲养笼中观察。

1.4 Western blot检测 TLR4、IRF-3 和IFN-β 表达

各组动物分别于再灌注1 d、2 d、3 d、4 d时间点（n=6）立即冰上断头取右侧皮质，加入适量的细胞裂解液 150 μl［0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris-HCl（pH7.6），0.001 mol/L EDTA （pH8.0），1 μg/ml aprotinin，100 μg/ml PMSF］，超声粉碎，离心。 用 Lowry法测定蛋白浓度。取总蛋白30μg经120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。转印，杂交，暗室内ECL反应，X线显影、定影。扫描蛋白印迹条带。

1.5 图像分析及统计学处理

蛋白条带用自动凝胶成像系统Chemi Imager 5500 V2.03软件进行扫描，用Fluor Chen 2.0软件进行分析测得平均光学密度值（integrated density value，IDV）。所得数据以x±s表示，用SPSS13.0统计软件作统计分析，样本均数间比较用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLR4蛋白表达结果

Western blot分析显示缺血再灌注组TLR4蛋白表达水平明显高于TLR4阻断组和假手术组（图1）。缺血再灌注组TLR4表达在1 d、2 d、3 d和4 d分别高于TLR4阻断组（P<0.05）。见表1。

表1 TLR4在小鼠右侧皮质表达的ID值（±s）Tab.1 The IDV of TLR4 expression at different reperfusion time point（±s）

表1 TLR4在小鼠右侧皮质表达的ID值（±s）Tab.1 The IDV of TLR4 expression at different reperfusion time point（±s）

1）P<0.05 vs Sgroup or T group.IDV，integrated density value；I，ischemia reperfusion group；T，TLR4 blocking group；S，shamgroup

Group n Reperfusion timepoint 1 d 2 d 3 d 4 d I 6 0.083±0.0321） 0.214±0.0211） 0.493±0.0341） 0.428±0.0051）T 6 0.069±0.016 0.133±0.009 0.197±0.016 0.186±0.015 S 6 0.057±0.008 0.126±0.006 0.138±0.003 0.152±0.007

2.2 IRF-3蛋白表达结果

Western blot分析显示缺血再灌注组IRF-3蛋白表达水平明显高于TLR4阻断组和假手术组（图2）。缺血再灌注组IRF-3表达在1 d、2 d、3 d和4 d分别高于TLR4阻断组（P<0.05）。见表2。

2.3 IFN-β蛋白表达结果

Western blot分析显示缺血再灌注组IFN-β蛋白表达水平明显高于TLR4阻断组和假手术组（图3）。缺血再灌注组IFN-β蛋白在再灌注1 d开始表达，3 d达到高峰，4 d开始下降（图3）。缺血再灌注组IFN-β表达在1 d、2 d、3 d和4 d高于TLR4阻断组（P<0.05）。见表3。

3 讨论

表2 IRF-3在小鼠右侧皮质表达的ID值（±s）Tab.2 The IDV of IRF-3 at different reperfusion time point（±s）

表2 IRF-3在小鼠右侧皮质表达的ID值（±s）Tab.2 The IDV of IRF-3 at different reperfusion time point（±s）

1）P<0.05 vs Sgroup or Tgroup.

Reperfusion timepoint 1 d 2 d 3 d 4 d I 6 0.085±0.0041） 0.272±0.0051） 0.523±0.0211） 0.159±0.0031）T 6 0.057±0.003 0.184±0.001 0.278±0.006 0.166±0.017 S 6 0.066±0.004 0.126±0.004 0.133±0.008 0.189±0.001 Group n

表3 IFN-β在小鼠右侧皮质表达的ID值（±s）Tab.3 The IDV of IFN-β in each group with different reperfusion time point（±s）

表3 IFN-β在小鼠右侧皮质表达的ID值（±s）Tab.3 The IDV of IFN-β in each group with different reperfusion time point（±s）

1）P<0.05 vs Sgroup or Tgroup.

Reperfusion timepoint 1 d 2 d 3 d 4 d I 6 0.191±0.0021） 0.207±0.0041） 0.727±0.0151） 0.506±0.0191）T 6 0.187±0.002 0.202±0.006 0.434±0.003 0.284±0.007 S 6 0.177±0.002 0.177±0.002 0.235±0.007 0.293±0.006 Group n

TLR4是一种跨膜蛋白受体，TLR4被激活后，其信号经由2条信号通路由胞外向胞内传导：MyD88依赖性途径和MyD88非依赖性途径，MyD88非依赖性途径又称TRIF依赖性，TRIF可激活TBK1 ［TRAFfamily-member-associated NF-κB activator（TANK）binding kinase 1］，TBK1由一个可诱导的 I-κBkinase（IKK-i）家族组成［5］。TBK1/IKK-i直接使IRF-3和干扰素调节因子7（interferon response factor 7，IRF-7）磷酸化［6］，磷酸化的 IRF-3 和IRF-7形成同源二聚体，转移到细胞核，导致IFN-β和一系列IFN诱导的基因表达［7］。目前，TLR4介导的TRIF信号通路的研究主要集中在对抗微生物感染的免疫反应中［8，9］，在脑缺血再灌注损伤中该通路是否介入尚未见报道。

由于IRF-3是TLR4信号传导通路的一个关键分子，本研究在脑缺血再灌注损伤激活TLR4后，观察了IRF-3及其诱导的IFN-β在小鼠皮质的表达。结果显示：缺血再灌注组IRF-3蛋白表达水平明显高于TLR4阻断组和假手术组（P<0.05），说明TLR4被激活后，引起IRF-3表达量增加，而采用TLR4抗体阻断后，IRF-3表达量减少。提示IRF-3参与了脑缺血再灌注TLR4激活后的信号传导路径。Western blot结果显示：缺血再灌注组小鼠的皮质在TLR4被激活并引起IRF-3的过表达后，IFN-β表达量显著高于TLR4阻断组和假手术组（P<0.05）；而采用TLR4抗体封闭TLR4阻断后，TLR4阻断组的IFN-β表达量明显低于缺血再灌注组（P<0.05），提示在脑缺血再灌注的病理发展过程中，TLR4-IRF-3-IFN-β信号通路可能被激活；阻断TLR4后，IRF-3和IFN-β表达量明显减少。目前，直接针对TLR4-IRF-3-IFN-β信号通路的研究较少，这一途径在脑缺血再灌注中所发挥的作用还有待于进一步深入研究。

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