VEGF在小剂量超短波促进种植骨髓间充质干细胞脱细胞支架修复大鼠坐骨神经损伤中的表达

庞超见，佟晓杰，刘贵波，李奇，贾桦，王莹，高海

（中国医科大学 基础医学院解剖学教研室，沈阳 110001）

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一类多功能的生长因子，通过与特异性的受体结合可促进内皮细胞增殖、诱导血管形成，对调节生理性与病理性血管生长起着重要的作用，因而被应用于缺血性血管疾病的治疗。随着组织工程学的不断发展，应用支架材料和种子细胞来修复周围神经损伤已经日趋成熟。骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSC）作为成体干细胞的一种具有多向分化、增殖迅速、长期存活和低免疫原性的特点，可用于神经损伤时组织工程化的种子细胞［1］。目前有许多可降解的人工材料已经应用到研究当中，例如聚乳酸、壳聚糖和聚羟基乙酸等，但是同种异体脱细胞神经细胞外基质材料（acellular extracellular matrix，AECM）作为有仿生性的神经替代物，更具有良好的仿生性、组织相容性和低免疫原性，移植后为轴突再生提供适宜的微环境，能够有效促进神经再生［2，3］。本研究利用组织工程学的方法修复神经损伤，观察种植BMSC的脱细胞支架修复大鼠坐骨神经缺损过程中VEGF、S-100蛋白表达及超短波（ultrashortwave，USW）治疗对VEGF表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药品

Wistar成年大鼠60只，体质量为200～250 g，雌雄不限。均由中国医科大学实验动物部提供。Triton X-100（Sigma公司）、脱氧胆酸钠（华美生物工程公司）、胰酶（Sigma公司）、抗 S-100抗体（Sigma公司）、抗VEGF抗体（美国Santa Cruze公司）、FITC（美国Santa Cruze公司）、TRITC（美国Santa Cruze公司），DAPI（美国Roche公司）等。

1.2 实验方法

1.2.1 化学萃取脱细胞方法制备AECM：无菌条件下，取Wistar大鼠坐骨神经，长度为15 mm，去除神经外膜用1号缝合线结扎神经段两端，在无菌蒸馏水低渗浸浴12 h；在4%Triton X-100中消化12 h；在无菌蒸馏水中漂洗3 h；在3%脱氧胆酸钠中持续振荡消化12 h，振荡速率120次/min；重复上述步骤4个周期。萃取神经段在4℃的无菌磷酸盐缓冲液（pH7.4）中保存备用。

1.2.2 BMSC的分离和培养：取Wistar雄性大鼠（20~30 d）3只，10%水合氯醛（0.3 ml/kg）腹腔内注射麻醉和无菌操作下，取出双侧的股骨和胫骨用0.01 mol/L PBS清洗后剪下干骺端两端，用装有含10%小牛血清达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM） 的 5 ml注射器从一侧穿入股骨髓腔内，冲出细胞悬液到50 ml的细胞培养瓶内，瓶置入37℃，5%CO2恒温培养箱中。48 h后换培养液，加新鲜培养基。根据细胞的形态和密度（占瓶壁面积60%～80%时）进行传代。

1.2.3 神经移植：取传至第3代BMSC，按1×106/ml的接种密度从经消毒处理的脱细胞支架的一端注射，然后置于培养皿，按上述培养条件培养72 h备用。实验鼠分为3组，即DMEM组、支架内注射BMSC组和支架内注射BMSC后应用超短波治疗组（USW组）。大鼠用10%水合氯醛腹腔内注射麻醉，手术显微镜下暴露坐骨神经，于梨状肌下缘5 mm处切除10 mm坐骨神经，分别将支架与两断端神经外膜缝合，USW组在术后应用超短波治疗，术后第2，4，8和12周分别取出移植部分。

1.2.4 超短波治疗：术后24 h，USW组开始实行超短波治疗。超短波治疗仪频率为14.24 MHz，输出功率为14.24 W，一对4 cm2的圆形电极放置在缝合处皮肤的两侧，距离皮肤1 cm，每日1次，每次7 min，在术后第2，4，8和12周分别取出移植的支架。

1.2.5 半薄切片甲苯胺蓝法染色：光镜观察有髓神经纤维数和轴突直径。

1.2.6 免疫荧光染色检测和积分光密度分析：按照不同的时间点在各组中随机选出2只大鼠并取材，用4%的多聚甲醛固定过夜，第2日用PBS冲洗3遍后置入30%的蔗糖溶液过夜，然后用OCT包埋作冷冻切片厚度为8μm，放置到用多聚赖氨酸包被的载玻片上。冷丙酮固定10 min，PBS洗5 min，0.5%Triton穿孔15 min，PBS漂洗2次，每次5 min，1%BSA封闭30 min，一抗为抗S-100抗体（1∶150稀释）和抗-VEGF抗体（1∶100稀释）混合液，或者是抗S-100抗体（1∶150稀释）和抗-GFAP抗体（1∶100稀释）孵育，4℃过夜；第2日PBS洗5 min，加二抗FITC（1∶200稀释）和 TRITC（1∶200稀释）混合液孵育 40 min，PBS洗 5 min，5μg/ml DAPI染色2 min，封片，荧光显微镜镜下观察。以计算机图像分析仪MPIAS-500检测积分吸光度值。

1.3 统计学分析

所有的数据使用SPSS13.0软件进行统计学处理和分析，数据以x±s表示，各组间比较采用t检验及Wilcoxon秩和检验，P<0.05为具有统计学差异。

2 结果

2.1 BMSC的评价

原代培养到3 d时，少许梭形BMSC贴附到瓶壁，另有一定数量红细胞悬浮瓶内。6～8 d时，单层贴壁的梭形纤维样细胞明显增多，并逐渐相互汇合成漩涡样生长，2周左右，单层贴壁的梭形纤维样细胞几乎布满瓶壁，细胞间隙减少。见图1。

2.2 再生神经纤维的组织学观察

甲苯胺蓝染色，显示单位面积内髓鞘化的神经纤维和神经束膜的数目随时间的增加而增多，组间比较差异有统计学意义（P<0.05），USW组的神经纤维数目最多。见图2。

2.3 VEGF、S-100蛋白表达

脱细胞神经支架构成的神经再生室为注入的BMSC的分化提供了很好的微环境。免疫荧光双标方法显示，术后不同时间点移植神经内部的施万细胞标志物S-100和VEGF在各组均为阳性，但在不同的时间点阳性程度或表达数量不同，在各组第4周时阳性程度最强（图3）。统计结果显示移植后12周再生神经的S-100和VEGF积分光密度值在USW组高于其他两组，且有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 移植后12周各组再生神经的S-100和VEGF的积分光密度值比较（x±s）Tab.1 The integrate optical density（IOD）of S-100 and VEGF in regenerated nerves in the three experimental groups at 12 weeks after surgery（x±s）

3 讨论

随着组织工程学的发展，可降解材料和种子细胞的结合为周围神经损伤的修复带来了新的解决途径。脱细胞支架拥有正常神经组织完整的基质和三维立体结构，提供了有利于再生的组织相容性好、通透性与空隙通道，可促进神经再生［4，5］。

施万细胞对于轴突再生是必不可少的，在周围神经损伤的修复过程中起核心的作用。在移植施万细胞到脱细胞支架内以促进神经再生的实验中，可以呈现施万细胞在促进修复中的意义［6］。但是由于施万细胞在体外分离、培养和扩增问题及其在体内异源免疫排斥反应等问题，使其在临床上的应用受到限制［7，8］。BMSC比较容易从供体中获得且有较大的可塑性，有多潜能分化能力，可在体外和体内被诱导成脂肪、成骨、骨骼肌、心肌、内皮和神经外胚层等多种细胞。BMSC可被诱导分化为施万细胞样细胞，以促进神经纤维的生长和神经髓鞘的形成［9］。

VEGF在正常成熟神经组织中不表达或少表达，而在许多病理情况下，如缺血、缺氧、外伤、神经系统脱髓鞘及代谢等，神经组织VEGF及其受体表达显著增高，这种反应性的增高对受损的神经组织起着神经保护与营养作用［10］。Hobson 等［11］用硅胶管将坐骨神经断端连接，制成长度为1 cm的再生室模型，局部注入VEGF，发现10～30 d期间，施万细胞明显增殖与迁移，轴突再生也较显著，且这种作用呈剂量依赖性。VEGF在神经再生的过程中起到以下的作用：VEGF刺激神经内血管与神经滋养动脉形成，能为神经轴突生长、施万细胞增生提供所必需的氧分及营养物质，保持神经微环境的稳定；VEGF通过直接作用于神经细胞膜上的受体，促进神经轴突生长，即VEGF促进神经再生是通过其促血管生长与神经营养双重的结合作用。

本实验发现作为施万细胞的特征性标志物S-100在各组再生的神经中有表达，并呈时间依赖性增多，在12周时达到顶峰，其中USW组在各时间点均表达最高。这说明在再生的神经内有施万细胞或施万细胞样细胞存在。有研究报道这类细胞来源有两种：一是由于组织微环境的存在使移植的BMSC在体内被诱导为施万细胞样细胞，从而分泌神经生长所需的因子促进神经再生［12］；二是这些细胞来自于损伤残端的近侧，自身的施万细胞迁移到支架内进而参与神经的再生过程。本实验经双标发现VEGF与S-100共存于施万细胞，表明该细胞也能分泌VEGF，而超短波治疗可促使其分泌或表达量的增加，从而更好促进神经轴突的再生。

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