复合天然抗氧化制剂的抗氧化、抗运动疲劳、抗神经细胞氧化损伤作用研究＊

于 飞,卫涛涛

(1.西北师范大学体育学院,甘肃 兰州 730070;2.中国科学院生物物理研究所,北京 100000)

许多蔬菜、水果、中草药不仅含有许多人体必需的营养素,还有丰富的抗氧化成份。复合天然抗氧化制剂是果、蔬、中草药复合制剂,主要有胡萝卜、番茄、芹菜和茄子等蔬菜,枸杞、沙棘、茶叶等中草药和葡萄等水果。以上主要原料中,均含有天然抗氧化剂,如胡萝卜中含有大量的β-胡萝卜素、蕃茄中富含番茄红素、芹菜中富含芹菜黄素、茄子中富含原花青素、枸杞中富含枸杞多糖、沙棘中沙棘油、茶叶中的茶多酚等,复合天然抗氧化剂是多糖类、多酚类、黄酮类的协同作用和科学配制,主要用作清除生物体内过多自由基。为此,对它的抗氧化性能、抗运动疲劳作用及抗氧化应激神经细胞损伤的保护功能进行研究。

1 材料与方法

1.1 抗氧化性能研究

1.1.2 对·OH的清除作用的测定10μl复合天然抗氧化剂(用 PBS适当稀释)与 10μl 1.2 mmol/L FeSo4溶液、10μl 0.4 mol/L DMPO溶液、10μl 1.0mol/L H2O2溶液混匀 90S后,用Varian E-109顺磁波谱仪记录 ESR波谱,通过第二条峰的高度表示体系中·OH的量。

1.1.3 对脂质过氧化反应抑制作用的测定10μl S861(用PBS适当稀释)与10μl小鼠脑匀浆(含0.1蛋白),10μl 5 mmol/L FeCL3/1.5 mmol/L FeSO4溶液、10μl 0.1 mol/L POBN溶液混匀,37℃温育1 h后立即用Bruker E-200顺磁波谱仪记录ESR波谱,通过第二组峰的高度表示体系中脂类自由基的量。

1.2 抗运动疲劳效果测定

主要测试小鼠力竭性游泳的持续时间、肝脏和骨骼肌中SOD活力及MDA含量。

昆明种成年健康雄性小鼠80只,体重(25±3)g。随机分为3组:各组均用标准固体混合饲料喂养,唯饮水不同:空白和实验对照组均用普通冷开水,实验组在普通冷开水中加入10%制剂原液。第5d进行实验,实验前禁食禁水12h。将实验组和实验对照组的小鼠称重后强迫游泳。水深30,水温(30±2)℃。力竭性游泳持续时间为自小鼠入水始,至沉底8S钟不能浮出水面止。沉底小鼠立即捞起断头处死,取肝脏、股四头肌的置液氮罐保存,备测SOD活力和MDA含量。用氮蓝四唑NBT法测定肝脏和骨骼肌中SOD活力。用硫代巴比妥酸TBA荧光比色法测定肝脏和骨骼肌中MDA的生成量。

1.3 抗氧化应激诱导脑细胞凋亡

主要通过测定经FeSo4处理后的脑细胞存活率和凋亡率来观察复合天然抗氧化制剂对脑细胞的保护功能。

取7日龄Wistar大鼠小脑,用Hanks液洗一遍,经胰蛋白酶作用后制成细胞悬液,置于经多聚赖氨酸包被的96孔培养板中培养。培养基为添加 KCL(19.6mmol/L),glutamine(2 mmol/L)、HEPES(10mmol/L)和胎牛血清 (10%,V/V)的DMEM。细胞在37℃培养48h后加入200μmol/L FeSO4,制备成氧化应激损伤脑细胞的模型供试。实验组在加入FeSO4之前,先加复合天然抗氧化制剂(终浓度2.5%原液)预处理15 min;对照组则不经复合天然抗氧化制剂预处理。加入Fe-SO4处理36 h后,加入0.5mg/ml MTT温育2 h,生成的沉淀用DMSO溶解后,测定570nm处的吸光度,计算细胞存活率。加入FeSO4处理36h后,将细胞收集到冷PBS中,用PBS洗两遍后再用70%乙醇在-20℃固定过夜。将细胞再洗三遍后加入0.1mg/ml RNaseA 37℃作用30min,作 PI染色。用Beckman Dickison FACScan流式细胞仪测定1×104cells的DNA含量。计算凋亡细胞的比率。

2 结果

2.1 抗氧化性能

(1)实验组较对照组的ESR波谱峰值显著降低。提示实验组的量显著减少(图1) 。

Fig.1 ESR spectrogram of

(2)实验组较对照组的ESR波谱峰值显著降低。提示实验组·OH的量显著减少(图2)。

经测定,复合天然抗氧化制剂对·OH也有极强的清除作用,但不及对的清除强度。100%原液浓度即可清除100%的·OH;50%原液浓度可清除56.7%±5.8%的·OH;25%原液浓度可清除28.5%±2.3%的·OH;12.5%原液浓度可清除14.8%±3.3%的·OH。

Fig.2 ESR spectrogram of·OH

(3)实验组较对照组的ESR波谱峰值显著降低。提示实验组能显著抑制脂质过氧化反应(图3)。

Fig.3 ESR spectrogram of L

经测定,复合天然抗氧化制剂对脂质过氧化反应有很强的抑制作用:只需6.3%浓度原液,即可达到28.8%±3.3%抑制率;12.5%浓度原液,可达到45.5%±2.3%抑制率;25%浓度原液,可达到50.8%±5.8%抑制率;100%浓度原液,可达88.0%±5.8%抑制率。

2.2 抗运动性疲劳

(1)力竭性游泳持续时间:实验对照组(180±37)min,实验组(260±45)min,较对照组延长80min,超过44%(P<0.01)。

(2)SOD活力及MDA含量:实验组的SOD活力及MDA含量均显著优于实验对照组 (表1见下页)。

2.3 抗神经细胞氧化损伤

2.3.1 脑细胞存活率 实验对照组的细胞存活率为59.6%;实验组的细胞存活率为84.6%。提示复合天然抗氧化制剂对脑细胞在200μmol/L FeSO4作用下有很好的保护作用(图4见下页)。

Tab.1 Effect from the mixed natural antioxidant on the content of MDA and the vigor of SOD of liver and muscle of athletic fatigued rats()

Tab.1 Effect from the mixed natural antioxidant on the content of MDA and the vigor of SOD of liver and muscle of athletic fatigued rats()

＊P<0.05,＊＊ P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsexperiment control

Group n SOD(U/g)Liver Muscle MDA(nmol/ml)Liver Muscle Control 40 6161±857 1875±345 1.28±0.31 1.16±0.56 Experiment control 20 5277±764＊＊ 1628±350＊ 1.80±0.38＊＊ 1.87±0.53＊＊Experiment 20 5506±626＊＊# 1719±271 1.43±0.21## 1.33±0.45#

Fig.4 Effect from the mixed natural antioxidant on the survival rate of oxidated injured brain cells

2.3.2 脑细胞凋亡率 不经过FeSO4处理的空白对照组,只有8.4%左右发生凋亡,实验对照组有40.5%凋亡;实验组仅16.7%凋亡。提示复合天然抗氧化制剂有很强的保护脑细胞,显著减少FeSO4引起的脑细胞凋亡(图5)。

Fig.5 Effect from the mixed natural antioxidant on the apoptosis rate of oxidated injured brain cells

3 讨论

3.1 复合天然抗氧化剂具有整体防御功能和较强的抗氧化性能

实验组较对照组的ESR波谱峰值显著降低。只需25%原液浓度即可清除 100%,并且清除过量的可以减轻自由基损伤。研究表明复合天然抗氧化剂对O有极强的清除作用。

·OH是活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基。·OH是脂质过氧化作用的主要引发剂[1]。经实验测定,它不仅能100%地清除·OH,而且只需50%浓度原液,即能55%清除·OH。表明复合天然抗氧化制剂对·OH也有极强的清除作用。只需25%浓度原液就能抑制50%以上的脂质过氧化反应。

3.2 复合天然抗氧化剂的抗运动疲劳性能

复合天然抗氧化制剂能显著延长小鼠游泳的持续时间,延缓运动性疲劳的出现,这与其抗氧化性能关系密切,运动疲劳研究水平由细胞、亚细胞深入到分子和离子水平,特别是自由基生物学在体育领域的研究和开展,对促进运动疲劳机制的研究起到积极作用[2]。实验数据显示,实验组肝脏中SOD活力显著低于空白对照组(P<0.01);实验对照组肝脏、骨骼肌中SOD活力显著低于空白对照组(P<0.01,P<0.05);实验组肝脏、骨骼肌中SOD活力显著高于实验对照组。表明力竭性游泳运动可引起小鼠肝脏和骨骼肌中超氧阴离子自由基生成增加,脂质过氧化加强;长时间耐力运动导致实验对照组小鼠肝脏和骨骼肌中MDA含量明显增加,而实验组小鼠肝脏和骨骼肌中MDA含量显著低于实验对照组。MDA过多是细胞氧化损伤和脂质过氧化反应的重要指标,本研究结果显示复合天然抗氧化剂能明显清除·OH,抑制MDA生成作用,减少脂质过氧化反应[3]。

3.3 复合天然抗氧化剂对氧化应激诱导脑细胞凋亡的影响

大量证据表明,运动诱导的自由基损伤和超氧化损伤涉及全身各个器官和组织,脑作为生物体的中枢,与其他组织相比,更易于受到氧化损伤[4]。首先,脑组织自身代谢速率快,氧消耗量很高,会产生较多量的活性氧;其次,神经细胞膜中不饱和脂肪酸含量很高,容易受到活性氧攻击;再次,由于中枢神经系统中相对较低的过氧化氢酶和谷胱甘肽氧化酶,因此,抗氧化能力较差。一旦运动使脑相对缺血缺氧,就会导致其微循环发生改变,从而影响脑的功能,使机体运动能力下降[5]。

研究结果表明,实验组的细胞存活率为84.6%,实验对照组为59.6%;不经过FeSO4处理的空白对照组细胞的凋亡率为8.4%,实验组仅16.7%,实验对照组为40.5%。用复合天然抗氧化剂预处理的实验组细胞能提高生存率,抑制细胞凋亡,显著保护脑细胞免受氧化应激损伤。

[1]周 玫,陈 媛主编.脂质过氧化作用及其对细胞的损伤.自由基医学基础与病理生理[M].北京:人民卫生出版社,2002.36-58.

[2]张 勇.运动性活性氧:从毒性分子到细胞信号枢纽.体育科学研究现状与展望[J].2005-2007:77-81.

[3]陈 瑗,周 玫.自由基与衰老[M].北京:人民卫生出版社,2004.29

[4]陈 彦,常 波,李 丽,等.不同药物对一次力竭游泳小鼠脑纹状体自由基代谢的影响.广州体育学院学报[J],2006,4:102-105

[5]李 雪,袁琼嘉,熊若虹.不同负荷运动对大鼠大脑皮质超微结构的影响[J].成都体育学院学报,2006,3:111-113.