川芎化学成分分离鉴定与藁本内酯的含量测定Δ

张 玲，刘友平，李旻，李惠勇，范婧娴

（成都中医药大学，成都市 611137）

川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）为常用中药，始载于《神农本草经》，味辛、微苦，性温，有活血化瘀、理气止痛等功效，常用于头痛及瘀血证的治疗。其化学成分研究国内、外报道较多，主要有挥发油、生物碱、酚（酸）性成分等[1～3]。藁本内酯作为川芎中主要有效成分，现代化学和药理研究表明，具有抗血小板聚集、松弛子宫和气管平滑肌、抑制中枢神经系统等活性[4，5]，在川芎中可达1%以上[6]，在川芎挥发油中达30%以上[7]。因此，藁本内酯可作为川芎药材质量评价的指标成分之一。笔者建立了川芎中藁本内酯分离方法，并建立了其含量测定方法以用于川芎药材的质量控制。

1 材料

1.1 仪器

SGW-4型显微熔点测定仪（上海精密科学仪器有限公司）；Bruker Avance 600型核磁共振（NMR）仪（瑞士Bruker公司）；Nicolet FTMS-2000型质谱（MS）仪（美国Nicolet公司）；LC-10A型高效液相色谱（HPLC）仪（日本岛津公司）；CLASS-VP工作站（日本岛津公司）；SPD-10A型紫外检测器（日本岛津公司）；ΜV-Vis 8500型紫外-可见分光光度（UV）计（无锡科达公司）；BP211D型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；BUG25-12型超声波清洗机（25 kHz，500 W，上海必能信超声波有限公司）；R-201型旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）。

1.2 试药

柱色谱硅胶（100～200目、300～400目，青岛海洋化工厂）；甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司）；其它试剂均为分析纯（成都市科龙化工试剂厂）；10份川芎药材样品分别收集于四川都江堰徐渡乡川芎中药材生产质量管理规范（GAP）基地及西南药都市场，经成都中医药大学中药鉴定教研室陈新副教授鉴定均为川芎L.chuanxiong Hort.的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

川芎粗粉1.5 kg经乙醇渗漉提取得提取物120 g；提取物50 g经硅胶柱色谱，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（9∶1，8∶2）梯度洗脱和石油醚（30～60℃）-乙醚（9∶1）洗脱得化合物1（150 mg）、2（15 mg）和3（88 mg），结构式见图1。

图1 化合物1～3的结构式A.化合物1；B.化合物2；C.化合物3Fig 1 Structural formula of compounds 1～3A.compound 1；B.compound 2；C.compound 3

2.2 结构鉴定

2.2.1 化合物1 浅黄色油状物，略有酯香味；UV λmax nm：207、283、320；（电子轰击离子源（EI）-MS）：m/z 190（M+），161（基峰），148，133，120，106，78，55。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：0.96（3H，t，J＝0.75，H-11），1.50（2H，m，H-10），2.38（2H，q，J＝7.5，H-9），2.46（2H，m，H-5），2.60（2H，t，J＝9.6，H-4）），5.23（1H，t，J＝7.8，H-8），6.01（1H，m，H-6），6.28（1H，d，J＝9.6，H-7），以上光谱数据与文献[8，9]报道的Z-藁本内酯（Z-ligustilide）相符。

2.2.2 化合物2 白色片状结晶（石油醚-乙酸乙酯），mp：134～136 ℃，NMR光谱数据见表1，与文献[2，10]报道的Z-6，8′，7，3′-二聚藁本内酯（Z-6，8′，7，3′-diligustilide）相符。

2.2.3 化合物3 白色粉末，mp：124～126℃，NMR光谱数据见表1，与文献[2，10]报道的Z，Z′-6，6′7，3′a-二聚藁本内酯（Z，Z′-6，6′7，3′a-diligustilide）相符。

表1 化合物2、3的1H（600 MHz）、13C-NMR（600 MHz）数据（CDCl3）Tab 1 The1H（600 MHz）and13C-NMR（600 MHz）data of compounds 2 and 3（CDCl3）

2.3 川芎药材中藁本内酯的HPLC含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：HypersiL ODS C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（60∶40）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：320 nm。在此色谱条件下，川芎药材中藁本内酯与其它组分能达到基线分离。色谱见图2。

2.3.2 标准品溶液的制备 取藁本内酯标准品约60 mg，精密称定，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液（2.42 mg·mL-1），精密量取1 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 取药材粉末（过3号筛）0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密闭，称重，超声提取45 min，取出，称重，加甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

图2 高效液相色谱图A.标准品；B.供试品；a.Z-藁本内酯Fig 2 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.teat sample；a.Z-ligustilide

2.3.4 线性关系考察 分别精密吸取藁本内酯标准品贮备液0.2、0.5、1、1.5、2 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，吸取上述不同浓度的标准品溶液各10µL，分别进样测定。以藁本内酯进样量（X，μg）对峰面积积分值（A）进行线性回归，得标准曲线方程A＝2167715X+116629（r＝0.9998）。结果表明，藁本内酯进样量在0.484～4.84 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验 取标准品溶液，依选定的色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果，RSD＝0.58%（n＝6），表明仪器精密度良好，

2.3.6 稳定性试验 分别取标准品溶液和供试品溶液于棕色瓶中，密闭、室温贮藏，于0、2、6、12、24 h 进样2次，测定藁本内酯的峰面积。结果，RSD分别为0.38%、0.86%（n＝5），表明藁本内酯在该溶液中稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 取同一样品粉末6份，照“2.3.3”项下方法制成供试品溶液，进样测定，计算藁本内酯的含量。结果，RSD＝1.89%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 取已知藁本内酯含量的川芎药材粉末约0.25 g，6份，精密称定，分别精密加入藁本内酯标准品溶液5 mL和甲醇10 mL，按“2.3.3”项下方法制成供试品溶液，分别测定藁本内酯的含量。结果，平均回收率为96.27%，RSD＝2.3%（n＝6）。

2.3.9 样品含量测定 取川芎样品，按“2.3.3”项下方法制成供试品溶液，各进样10 μL，测定2次，根据回归方程计算样品中藁本内酯的含量，结果见表2。

表2 不同批次川芎药材中藁本内酯的质量分数Tab 2 Mass ratio of ligustilide in different batches of L.chuanxiong

3 讨论

由于川芎中挥发油类成分在室温条件下不稳定，易发生脱氢、氧化等反应，故本试验采用乙醇渗漉、低沸程溶剂洗脱分离，条件温和，经济高效，能使川芎中挥发性成分不被破坏，得到较好的分离。

藁本内酯在川芎药材中含量较高，药理作用明确，但因其在室温条件下稳定性较差，是否能作为川芎含量测定指标成分尚存在争议。本试验以分离自制的藁本内酯为标准品，建立了HPLC含量测定方法，对所收集的10批次药材进行了含量测定，按药材中所含水分10%计，暂定标准为：川芎药材中藁本内酯含量以干燥品计不低于7.0%。

[1]袁昌齐.天然药物资源开发利用[M].南京：江苏科学技术出版社，2000：31.

[2]肖永庆，李 丽，游小琳，等.川芎化学成分研究[J].中国中药杂志，2002，27（7）：519.

[3]王文祥，顾 明，蒋小刚，等.川芎化学成分研究[J].中草药，2002，33（1）：4.

[4]国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草（第5卷）.[M].上海：上海科学技术出版社，1999：976、893.

[5]陶静仪.当归成分藁本内酯平喘作用的实验研究[J].药学学报，1984，19（8）：561.

[6]吴广通，石力夫，胡晋红，等.超临界流体萃取法测定川芎中藁本内酯含量的研究[J].药学学报，1998，33（6）：457.

[7]林燕芝，唐 星，毕开顺.RP-HPLC测定川芎挥发油中藁本内酯的含量[J].中国中药杂志，2004，29（2）：154.

[8]Kaouadji M，Pachtere FD，Pouget C，et al.Three addition phthalide derivatives，an epoxymonomer and tow dimers，from Ligustium wallichii Rhizomes[J].J Nat Prod，1986，49（5）：872.

[9]金灯萍，彭国平，陆晓峰.川芎中藁本内酯对照品的制备[J].中草药，2006，37（1）：65.

[10]苏东敏，庾石山，秦海林.当归中新的二聚苯酞衍生物[J].药学学报，2005，40（2）：141.