辐射损伤所致血虚证小鼠模型及四物汤反证的代谢组学研究*

霍 超 ，王 穆 ，马增春 ，张 琪 ，颜贤忠 ，张伯礼 ，高 月

（1.军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理与毒理研究室，北京 100850；

2.军事医学科学院生物医学分析中心，北京 100850；3.天津中医药大学，天津 300193）

辐射损伤所致血虚证小鼠模型及四物汤反证的代谢组学研究*

霍 超1，王 穆1，马增春1，张 琪2，颜贤忠2，张伯礼3，高 月1

（1.军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理与毒理研究室，北京 100850；

2.军事医学科学院生物医学分析中心，北京 100850；3.天津中医药大学，天津 300193）

[目的]通过检测辐射损伤所致血虚证及用四物汤干预治疗后小鼠内源性代谢物的变化，确定辐射损伤所致血虚证小鼠的血清及组织相关的生物标记物，基于代谢组学的方法考察血虚证证本质及四物汤的作用机制。[方法]C57小鼠按体质量随机分为正常组、辐射造模组、四物汤反证组。造模7 d后于小鼠股动脉取血，同时取脾脏、胸腺及股骨骨髓，并分别提取血清及组织的脂溶性和水溶性代谢物。[结果]主成分分析结果显示正常组、血虚证模型组以及四物汤反证组能够明显的区分。[结论]四物汤治疗血虚证的机制可能与稳定细胞膜，维持细胞内外渗透压平衡；调节糖酵解，促进机体正常能量代谢以及增强机体抗氧化能力、免疫力有关。

辐射；四物汤；血虚证；代谢组学；核磁共振

血虚证是临床常见证候，表现为血液亏虚、脏腑百脉失调、全身虚弱等。有关血虚证的动物模型造模方法的研究已经开展了大量的工作，其中γ射线造模是发展比较成熟的方法之一，辐射主要造成白细胞下降，骨髓造血功能障碍[1]。四物汤是治疗中医血虚证的首选药，课题组已经在外周血象、骨髓造血干/祖细胞的数量和质量、CD34+细胞表达，细胞周期、细胞凋亡和造血及免疫相关基因、蛋白的表达等方面考证了其药理作用[2-5]。实验利用基于核磁共振波谱（NMR）技术检测与造血和免疫相关的体液和组织，如血清、胸腺、脾脏和骨髓的提取物，希望从生化代谢的分子层面找出与辐射所致血虚证及四物汤反证相关的代谢谱变化，从中发现相关生物标记物，对血虚证的病理实质及四物汤的药理作用做进一步探讨。

1 材料与方法

1.1 药物来源及制备 四物汤由熟地黄、当归、白芍、川芎组成，按《太平惠民和剂局方》规定的剂量比例组成。药物按本室以前报道方法制备[5]。

1.2 动物分组与处理 实验用C57小鼠30只，体质量（18±2）g，购自军事医学科学院实验动物研究中心，合格证号为SCXK-（军）-2002-001。将小鼠按体质量随机分为正常对照组、模型组和四物汤反证组，小鼠常规饲养数天适应环境后，模型对照组和四物汤组采用60 Coγ射线全身1次照射，照射剂量3.5 Gy。照射后四物汤反证组立即灌以四物汤药液[10 g/（kg·d）]，连续灌胃7 d[6]。

1.3 样品制备及处理 于造模后第7天对各组动物进行股动脉取血制备血清，处死动物后取胸腺、脾脏以及股骨上段骨髓。按照参考文献进行1维氢谱（1H）NMR检测样品制备[7]。

1.41H NMR数据采集 血清：分别采用弛豫编辑脉冲序列（CPMG）、扩散编辑脉冲序列（LED）进行试验，采用预饱和方式抑制水峰，核磁共振自由感应衰减（FID）信号经过傅立叶变换转为一维NMR谱图。调用VNMR程序分别将CPMG谱的δ4.4～0.4以及LED谱的δ6.0～0范围内的谱峰进行分段积分。将积分数据归一化之后输出，用于模式识别分析[8]。

组织提取物：采用有预饱和的1D核欧豪斯效应分光光度法（NOESY）脉冲序列，在弛豫延迟期间采用预饱和方式抑制水峰。FID信号经过傅立叶变换转换为一维NMR图谱。以2，2，3，3－三甲基甲硅烷基丙酸（TSP）为化学位移参考峰的位置，将δ6.0～0.4（水溶性成分）以及 δ8～0（脂溶性成分）内的谱图进行分段积分，将所产生的所有积分数据归一化，用于进行模式识别分析[9]。

1.6 主成分分析 将所得到的数据文件输入SIMCA-P10.0软件包进行PCA分析，必要时加上正交信号校正处理。

2 实验结果

2.1 辐射损伤所致血虚证小鼠血清代谢组学变化分别采用CPMG和LED序列检测血清。结果显示，正常组、辐射损伤所致血虚证模型组以及四物汤反证组血清代谢物的组成在第一主成分（PC1）上能够明显区分（图1A、C）。从因子载荷图中（图1B、D）我们可以进一步发现对这种区分贡献最大的代谢物分别为：葡萄糖、肌酐、磷酸化胆碱、胆碱、肌酸、乳酸、低密度脂蛋白。其中磷酸化胆碱、肌酸、低密度脂肪酸的含量上升，药物处理后其含量下降；葡萄糖、胆碱、乳酸的含量下降，给予四物汤处理后其含量上升。

图1 综合放血法所致血虚证及四物汤反证小鼠血清代谢物变化的分析结果Fig.1 Analysison serum metabolic product inm icewith blood efficiency induced by synthetic blood-letting and with contrary syndromeof SIWu decoction

2.2 辐射损伤所致血虚证小鼠胸腺提取物的代谢组学变化 对胸腺水溶性和脂溶性提取物的主成分分析发现，正常组、辐射损伤所致血虚证模型组以及四物汤反证组之间能够明显的区分。其中，在水溶性提取物的主成分分析结果显示，辐射损伤所致血虚证模型组与正常组和四物汤反证组两组在第一主成分（PC1）与第二主成分（PC2）上均能有效的区分。

2.3 辐射损伤所致血虚证小鼠脾脏提取物的代谢组学变化 对脾脏水溶性提取物的主成分分析的结果显示，辐射损伤所致血虚证模型组和四物汤反证组两组与正常组之间有明显不同，而模型组和四物汤反证组之间并不能有效的区分；对脂溶性提取物的主成分分析显示，正常组与辐射损伤所致血虚证模型组以及四物汤反证组在第一主成分（PC1）上能够明显的区分。

2.4 辐射损伤所致血虚证小鼠骨髓提取物的代谢组学变化 对骨髓水溶性提取物的主成分分析发现，正常组与辐射损伤所致血虚证模型组以及四物汤反证组之间在第一主成分（PC1）上和在第二主成分（PC2）上均能够明显的区分；对骨髓脂溶性提取物的主成分分析发现，正常组和四物汤反证组两组与辐射损伤所致血虚证之间有明显的不同，四物汤反证组与正常组有重叠的趋势。

4 讨论

乳酸是糖酵解过程正常代谢产物，在缺氧的条件下在乳酸脱氢酶的催化下由丙酮酸生成，维持机体正常的能量代谢[10]。乳酸水平的异常提示机体能量代谢失调，机体无氧氧化功能受损；四物汤反证后，能够明显逆转上述效应，因此可以推测四物汤能够改善机体的能量代谢。胆碱是乙酰胆碱的重要前体，是体内的重要的甲基供体，是能量代谢和脂类代谢的重要参与者[11]。胆碱相对含量的改变就进一步说明了血虚证模型中存在着能量代谢功能的损害，并提示机体可能有脂类代谢的失调，四物汤能够明显逆转血虚证模型中胆碱含量的改变，可能与四物汤能够改善机体的能量代谢和脂类代谢有关。牛磺酸是体内一种重要的含硫氨基酸，具有稳定细胞膜，协助钙离子、镁离子、钠离子、钾离子（Ca2+、Mg2+、Na+、K+）等离子的转运、维持细胞内外正常的渗透压的功能[12]。研究发现四物汤能够改善造模后机体中牛磺酸的相对含量的改变，提示四物汤在维持细胞膜稳定方面有一定的作用。丙氨酸是体内重要的非必需氨基酸，有研究显示丙氨酸是淋巴细胞再生及免疫过程中重要的参与者[13]；谷氨酰胺是体内最丰富的游离氨基酸之一，具有重要的免疫调节作用，是淋巴细胞分泌、增殖及其功能维持所必需的，研究发现在模型组中丙氨酸和谷氨酰胺的含量发生变化，由此推断辐射造成机体的免疫功能受损，四物汤可以调节机体免疫功能。

综上所述，辐射损伤所致血虚证的机制可能与机体无氧氧化功能受损、能量代谢和脂类代谢失调、细胞内外渗透压平衡破坏、机体免疫功能失调有关。经典补血方剂四物汤治疗血虚证的机制可能与稳定细胞膜，维持细胞内外渗透压平衡，调节糖酵解，促进机体正常能量代谢以及增强机体抗氧化能力、免疫力有关，其深入的作用机制还有待进一步探索。

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NMR-spectroscopy-basedmetabonom ic study on themousemodelof blood deficiency syndrome induced by radiation

HUOChao,WANGMu,MA Zeng-chun,etal
（Beijing Institute ofRadiation Medicine，Beijing 100850，China）

[Objection]To explore the essence ofblood deficiency syndrome and themechanism of the effectsof Siwutang based on the characteristic changes in metabolic profiles of C57 mice with blood deficiency induced by radiation before the treatment of Siwutang.[Methods]Thirty C57 mice were random ly divided into three groups of 10 animals:the control group and two blood deficiencymodel groupswithoutorwith Siwutang treatment.The animalswere sacrificed the 7th day after radiation and the blood,spleen,thymusand bone marrow were obtained.Themetabolic profilesofserum,aqueousand lipidic extractsof thymus,spleen and bonemarrow were investigated using 1H nuclearmagnetic resonance spectroscopy(NMR).The NMR spectrawere integrated in segments of 0.01 ppm,normalized and then analyzed using SIMCA-P software to visualize the similarities and differences inmetabolic profiles between these groups.[Results]Compared with the control group,themodelgroup contained different levels of lactate,choline,glucose,taurine,alanine,LDL,glycerin,UFA,creatinine,histidine,valine/leucine/isoleucine.In the Siwutang treated group,the above-mentioned changeswere reversed.[Conclusion]The injury established by radiation wasa kind ofpropermodel to develop furthermetabonomics researches.The disorderofenergymetabolism and osmoregulation，and the damage of immune function were observed by NMR-based-metabonomicsmethod.Siwutang,the classic complex for treating blood deficiency in clinic,could improve the immune function,accommodate energymetabolism and stabilize cellularmembrane.

radiation;Siwutang;blood deficiency;metabonomics;NMR

R285.5

A

1672-1519(2010)03-0233-03

国家自然基金资助项目（30672628，30730112）。

霍 超（1986-），女，硕士，主要从事中药的代谢组学研究。

2010-01-30）