线粒体移动相关基因miro1在急性运动中的表达特征

刘慧君 翟克敏 赵斐 靳庆勋 乔海荣 刘洪涛 吉力立3， 张勇，

1军事医学科学院卫生学环境医学研究所（天津 300050） 2天津体育学院天津市运动生理与运动医学重点实验室（天津 300381） 3 Department of Kinesiology，University of Wisconsin-Madison，Madison，WI53706，US

线粒体作为真核细胞的“动力站”，在细胞中不断地进行着移动、分裂与融合，线粒体移动分布的改变会影响诸如线粒体呼吸功能、线粒体在高能量需求位置定位、Ca2+稳态等［1］，且线粒体移动的改变、线粒体定位异常与机体发育、多种神经系统疾病密切相关［2，3］。目前线粒体移动相关的分子生物学机制研究发现：多种哺乳动物细胞中Miro和Milton形成复合物与kinesin（马达蛋白）连接，调控线粒体沿微管的移动［4，5］。Miro蛋白有 Miro1、Miro2两种亚型，Miro1突变会抑制线粒体运输，导致线粒体聚集成簇，并形成丝状线粒体［6］。Masao Saotome等研究还发现不同Ca2+水平下，Miro对H9C2及原代脑皮层神经细胞线粒体融合分裂具有双向调节作用［7］。可见，Miro对维持线粒体正常的形态具有重要意义，并且可能通过线粒体形态分布的网络结构变化调整细胞内不同区域的能量分配以及促进胞内Ca2+信息传递。

目前对骨骼肌这一能量代谢很旺盛的细胞线粒体移动分布的研究鲜见报道，且线粒体移动是否参与了运动能量代谢的应答尚不清楚。本实验以急性运动为模型，研究骨骼肌在运动能量需求变化中，线粒体移动基因表达的动态变化，并初步探讨线粒体能量代谢、H2O2生成与线粒体移动基因动态表达之间的可能关系及其生理意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雄性 C57 BL/6小鼠 40只（19～21g），7～8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（SPF级），于正式实验前一周购入，在本实验室分笼饲养，自由饮食，饲料为标准啮齿类饲料。饲养环境为21～24℃，相对湿度45%～55%，每日光照12h。将小鼠随机分为5组，组间体重无显著性差异。其中1组为安静对照组（R，n=8），4组为急性运动组，分别以各时间点代表不同组：运动30min组（E30，n=8）、运动 60min组（E60，n=8）、运动 90min组E90，n=8）、运动 120min 组（E120，n=8）。

1.2 急性运动模型

以跑台运动作为运动应激模型。实验前所有动物均未进行过跑台运动。正式实验前，动物先在跑台上进行5min跑步以适应跑台环境（0°，5m/min）。运动组正式实验采用中等强度运动（0°，13m/min）。

1.3 骨骼肌样品制备及线粒体的提取

安静对照组动物于安静状态、其它组于运动中不同时间点（E30、E60、E90、E120）即刻颈椎脱臼处死，迅速取出下肢骨骼肌，部分样本液氮速冻，－80℃冻存备用进行基因测定；另外部分骨骼肌样本立即进行H2O2测定及差速离心法提取线粒体。以上操作均在冰浴中进行。

1.4 线粒体生物力能学指标检测

用 Oxytherm液相氧电极（Hansatech，UK）测定密闭反应体系中氧浓度的变化，以确定线粒体耗氧速率。测定以苹果酸和丙酮酸为底物的态3、态4呼吸速率（单位为nmol/min·mg pro），呼吸控制比（respiration control rate，RCR），RCR是态3呼吸速率与态4呼吸速率的比值，此数值反映线粒体的呼吸功能。

1.5 骨骼肌H2O2的测定

根据H2O2与钼酸铵作用生成稳定的黄色过氧钼酸络合物的原理，用可见－紫外分光光度计（Beckman Co，USA），波长405nm测定其络合物生成量可计算H2O2的浓度。剪碎组织，去除筋膜、脂肪；加入生理盐水，用玻璃匀浆器匀浆；2500r/min 4℃离心 10min，取上清，严格按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行检测。

1.6 ATP合成酶活性测定

采用荧光素－荧光素酶发光法［8］，用 20/20n型发光仪（TurnerBiosystem Co，USA）测定ATP合成酶活性。反应温度为25℃，在0.5ml反应体系中含有EDTA 0.5mM，HEPES 10mM，磷酸钾缓冲液5mM，MgCl22.5mM，荧光素－荧光素酶 100μl，0.5M 苹果酸 /0.25M 谷氨酸，50μg线粒体。记录以上体系中发光强度为本底，加入4μM ADP后启动线粒体ATP合成反应，记录发光强度。在不加线粒体及ADP的平行实验中，加1nM ATP，记录发光强度作为ATP合成量的标定（酶活力单位：nmol/min·mg pro）。

1.7 骨骼肌miro1 mRNA荧光定量PCR分析

使用 Trizol（Invitrogen）提取骨骼肌总 RNA，通过0.8%的琼脂糖电泳和紫外分光光度计确定总RNA完整性和纯度；严格按照RevertAid First Strand cDNA Syn thesis Kit（Fermentas）说明书进行逆转录反应。采用Applied Biosystems StepOneTMReal-Time PCR System（BIORAD，USA）进行荧光定量PCR反应，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。miro1上游引物5’-CTGATTATGTCGCTGGTCAGTGAAG-3’，下游引物 5’-GGTGACGTCAGCTGGAATGG-3’，产物 84bp；18S rRNA 上游引物5’-GGGAGCCTGAGAAACGGC-3’，下游引物 5’-GGGTCGGGAGTGGGTAATTT-3’，产物68bp。荧光定量 PCR条件：预变性 95℃/30s，95℃/5s，60℃/30s，共 40个循环。根据 SYBR～Premix Ex Taq Kit（BIO-RAD）说明书配制反应体系，目的基因的相对变化量（Fold Change）＝2－Δ（ΔCT），ΔCT=CTtarget-CT18s，Δ（ΔCT）=ΔCTstimulated-ΔCTcontrol。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 miro1 mRNA含量的变化

如图1所示，120分钟运动过程中miro1 mRNA表达均较安静组显著升高，E30、E60、E90、E120 组分别较安静组升高32.8%、107.6%、63.8%及44.8%，E60组达峰值。

2.2 线粒体ATP合成酶活性及呼吸速率变化

如表1所示，E30组ATP合成酶活性较安静组明显升高，其余各组均无明显变化。整个运动过程中线粒体RCR无显著变化。

表1 急性运动中骨骼肌线粒体力能学分析

2.3 骨骼肌H2O2浓度变化

如图2所示，120分钟运动过程中骨骼肌H2O2均较安静组显著升高，其中E30、E60和E90组H2O2持续升高，分别较安静组升高了 22.1%、26.7%、37.6%，E90组达峰值。

3 讨论

近些年，越来越多的研究证据表明线粒体形态分布的动态改变与能量代谢、细胞生理病理密切相关。线粒体与细胞骨架的相互作用会影响能量代谢及线粒体在高能量需求位置定位、Ca2+稳态、线粒体呼吸功能、融合分裂等［2］。如：牛晶状体表皮及上皮细胞线粒体移动发生改变的同时线粒体内膜电位也发生变化，揭示线粒体通过移动使能量从线粒体网络的低能量区域传播到高能量需求区域［9］；心成肌细胞及原代脑皮层神经细胞胞浆中游离钙离子浓度（［Ca2+］i）水平不同时，线粒体移动可调控线粒体融合分裂的动态变化［7］。这些实验结果提示：线粒体移动参与细胞内信息传递、能量交换。线粒体移动的分子机制研究表明：线粒体移动相关蛋白Miro属于小GTPase家族，位于线粒体外膜，含两个Ca2+结合的EF手型结构域［4］。H9C2 及原代脑皮层神经细胞中，［Ca2+］i静息水平时，过表达Miro增强线粒体移动并促进线粒体趋于融合；［Ca2+］i升高或钙振荡时，过表达Miro促进线粒体趋于分裂［7］。COS-7及HEK293T细胞中Miro1突变导致线粒体聚集成簇，形成丝状线粒体，影响线粒体移动及分布［6］。果蝇缺失dmiro会影响线粒体沿微管移动，导致部分神经传递功能缺失［10］。截至目前，运动应激过程中，骨骼肌这一能量代谢很旺盛的组织与线粒体移动分布的研究尚未见报道。本研究发现：一次中等强度负荷急性运动过程中，C57小鼠骨骼肌miro1 mRNA表达均较安静组显著升高，其中E60组较安静组升高了107.6%。这说明急性运动过程中，线粒体移动相关基因miro1表达迅速增加，线粒体可能通过移动、动态分布的改变适应细胞能量需求的急剧变化。

此外，本研究结果表明：急性运动中E30组ATP合成酶活性较安静组显著增加，其余各组无明显变化；整个运动过程中线粒体呼吸控制比较安静组升高，但无显著性变化。这说明急性运动初期线粒体ATP合成速率加快，在急性运动时间延续过程中线粒体能量代谢水平尚可满足能量需求的变化。以上结果提示：急性运动中，因线粒体移动相关基因miro1表达增加而活跃的骨骼肌线粒体移动，可能利于促进线粒体呼吸和ATP合成，以应对组织能量需求的变化。

是什么因素诱导线粒体移动基因表达迅速增高，拟或也对能量需求变化产生快速应答？尽管目前对线粒体移动调控机制的认识尚不清晰，但相关研究表明：多种细胞中局部Ca2+、NO浓度变化均可调控线粒体移动动态改变［11，12］。本研究结果表明：急性运动中骨骼肌 H2O2均较安静组显著升高，其中E30、E60和E90组H2O2持续升高，E90组达峰值，E120组比E90组略有降低但仍明显高于安静组。已知线粒体呼吸链产生的超氧阴离子（O2-·）、H2O2等自由基是细胞中ROS的95%来源，它们对调节细胞氧化还原状态、信号转导和细胞凋亡调控等都有重要作用。研究表明，细胞内ROS信号系统与钙信号系统之间具有密切的相互作用［13，14］。根据已有研究及本文现有结果提示：一次急性运动导致骨骼肌细胞对能量需求急剧增加的同时伴随H2O2生成急剧增多，H2O2可能作为信号分子调控Ca2+，Ca2+与线粒体移动相关蛋白miro结合影响线粒体移动［7，15］，调节线粒体在工作细胞内的重新分布，从而有助于线粒体与胞浆和其它细胞器之间的物质、信息和能量交换。

目前，对线粒体移动的研究尚不够深入，还未见骨骼肌细胞线粒体移动的报道，以至于我们对其具体的调控机制和生理意义知之甚少。本文在急性运动中发现的骨骼肌线粒体移动相关基因的表达特征，是否作为一个与运动能量代谢相关的“早期细胞事件”参与了线粒体的能量转换调节，这一事件与ROS和Ca2+等信号分子作用的关系及其是否通过调节线粒体融合与分裂影响线粒体动态重构等值得待进一步深入研究。

4 总结

C57 BL/6小鼠一次中等强度负荷跑台运动中，与安静对照组相比miro1 mRNA表达显著增加，骨骼肌H2O2显著增高，E30组ATP合成酶活性明显增加，线粒体呼吸控制比无显著变化。提示急性运动中骨骼肌线粒体移动相关基因miro表达增加，可能利于促进线粒体呼吸和ATP合成，以应对工作细胞能量需求的变化。

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