不同人群血清的中华绒螯蟹过敏原特异性IgE检测

黄海波,陈味味,陈 伟,李 娟,李雪頔,刘群英

(江南大学 1.医药学院 生物制药系;2.校医院,江苏 无锡 214122)

蟹类是我国市场上最常见的甲壳类水产食品,也是常见引起食源性过敏疾病的食物之一[1-2]。随着社会经济的发展和物质生活水平的不断提高,我国食源性过敏疾病的发病率也呈上升趋势,因此,食物过敏已经成为食品安全问题之一[3]。本文以中华绒螯蟹过敏原蛋白提取物为诊断抗原,采用ELISA间接法检测1907例人群血清中的特异性IgE,比较分析不同人群对蟹类食物的过敏反应性,为蟹类食物过敏症的临床诊断与防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 血清样品

1907例人群血清从江南大学校医院收集,其中2008级本科入学新生1379例,2008级浙江大学远程学生158例,2008年本校职工体检370例,样品收集时间为2008年9月至11月。

1.2 试剂与仪器

辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗人IgE为美国KPL公司产品;牛血清白蛋白(BSA)、3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺(TMB)、过氧化脲均为加拿大BBI公司产品;MK3型酶标仪为美国热电公司产品。

1.3 蟹过敏原蛋白提取物制备

取鲜活的中华绒螯蟹(购自无锡水产品市场)去除甲壳,挑取纯净肌肉组织用匀浆机匀浆后,按体积比1∶15的比例加入丙酮,置4℃冰箱脱脂,每天换液1次,期间搅拌2 h。48 h后滤去丙酮,干燥后称重,每1 g样品加入0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)15 mL,置4℃48 h,期间每天搅拌 2 h。4℃,12000 r/min离心20 min,收集上清,取样测定蛋白浓度,其余置-35℃保存。

1.4 酶标反应板预包被与血清特异性IgE的检测

酶标反应板预包被与封闭:蟹过敏原蛋白提取物用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)调整浓度至5 μ g/mL,包被96孔酶标反应板,50 μ L/孔(250 ng/孔),37 ℃孵育1 h,置4℃过夜,次日用PBS洗涤5次,加1%BSA封闭液220 μ L/孔,37 ℃孵育3 h,置4 ℃过夜,次日用PBS洗涤5次,密闭置4℃备用。

血清特异性IgE检测:取待检血清加入预包被的酶标反应板,50 μ L/孔;每块反应板设置空白孔,加入酶标抗体稀释液50 μ L/孔。置37℃温箱孵育30 min,用PBS洗涤5次;加入1∶2000稀释的HRP-羊抗人IgE,50 μ L/孔,37℃温箱孵育 30 min,用PBS洗涤5次;加底物TMB和过氧化脲显色15 min,1 mol/L硫酸终止反应,以空白孔调零测定A450值。

1.5 阳性/阴性判定值(Cut off)的确定

从本院学生中选择10例已知无任何食物和药物过敏史的健康志愿者,采集血清样品按1.4项下方法操作,测定 A450值,计算Cut off值。Cut off值=Σ A450/10×3。

1.6 数据分析

采用χ2检验进行统计学分析。

2 结 果

2.1 蟹过敏原蛋白提取物制备

经脱脂处理和PBS提取得到的蟹过敏原蛋白溶液,蛋白浓度为4.3 mg/mL。

2.2 血清特异性IgE的检测与分析

3组人群共1907例血清样本的特异性IgE检测结果见表1,统计学分析显示,不同人群组之间血清中蟹过敏原特异性IgE阳性率有极显著差异(χ2=121.29,P＜0.01)。组间分析表明,教职工组人群的血清特异性IgE阳性率显著高于两组学生人群(教职工组与2008级学生组之间χ2=114.13、与浙大远程学生组之间χ2=27.65,P＜0.01),而两组学生人群之间血清特异性 IgE阳性率无差异(χ2=0.07,P＞0.05)。

表1 3组人群血清中蟹过敏原特异性IgE的检测结果Tab.1 The detection results of specific IgE to crab allergic protein in the sera from three group people

2.3 Cut off值的确定

根据10例志愿者血清特异性IgE测定的A450值(见表2),计算的Cut off值为0.159。

表2 10例健康志愿者血清特异性IgE检测结果Tab.2 The results of specific IgE detection of the sera from healthy volunteer

3 讨 论

近年来,食品安全日益受到国内外的广泛重视。在食源性疾病中,因食物中的过敏原引起的过敏反应是一大类常见的临床疾病,对人们的身体健康和生命安全造成了很大的影响[4]。随着食源性过敏疾病发病率的上升,食物过敏症的诊断与防治成为我国医药科研的新内容之一。

因进食蟹类食品引起的超敏反应疾病包括过敏性紫癜、荨麻疹、过敏性哮喘、过敏性胃肠炎、过敏性鼻炎等。宋红霞等[5]对120例过敏性紫癜患者分析特异性IgE结果表明,蛋白食物组过敏原以虾/蟹阳性率最高(15.8%),许等[6]也发现过敏性紫癜患者中食入组过敏原阳性率以虾、蟹居首位。因进食蟹类食物发生严重过敏者甚至发生过敏性休克[7]。

过敏性疾病的发生除了具有个体遗传差异之外,还具有明显的地域特点,与患者的生活居住环境、变应原物种、以及过敏原接触史等密切相关。本文针对蟹类过敏原特异性IgE的检测结果也显示,不同人群中蟹过敏原特异性IgE的检出率有显著差异。3组人群中,江南大学学生来自除西藏、香港、澳门、台湾以外的全国30个省市和自治区,浙大远程学生主要来自江苏省南部地区(无锡、宜兴、江阴、镇江、扬州),而两组学生人群之间血清特异性IgE阳性率无差异(P＞0.05),表明蟹类食物过敏症在国内人群的地域特点不明显;教职工生活居住在当地,但教职工人群血清的特异性IgE阳性率显著高于学生人群的阳性率(P＜0.01)。笔者分析认为,由于学生人群的饮食主要集中在食堂,而学生食堂一般极少提供价格较高的蟹类菜肴,因此学生人群接触蟹类过敏原的机会相对较少;教职工主要为家居饮食而且条件较优裕,接触蟹类过敏原的机会相对较多。由此提示,蟹类食物过敏症的发生主要与个体差异和人群的饮食条件密切相关。

目前,我国临床上对各种过敏性疾病的实验诊断,主要采用过敏原体外检测法和特异性IgE体外检测法,使用的检测试剂主要依赖进口,如美国ASI公司生产的IVT过敏原体外检测试剂盒[8]。鉴于变应原物种的差异和过敏性疾病的地域特点等因素,有必要研究开发适合我国地域特点和人群的过敏性疾病诊断试剂,实现检测试剂的国产化。本文结果表明,以蟹过敏原蛋白提取物为抗原检测血清特异性IgE具有诊断意义,可为临床蟹类食物过敏症的诊断和防治提供实验诊断依据。

[1]Sicherer S H,Sampson H A.Food allergy[J].J Allergy Clin Immunol,2006,117(2 Suppl):S470-S475.

[2]LehreR S B,Ayuso R,Reese G.Seafood allergy and allergens:a review[J].Mar Biotechnol,2003,5(4):339-348.

[3]王晓斐,李振兴,林洪,等.中国对虾主要过敏原的鉴定及理化性质[J].水产学报,2008,32(2):273-278.

[4]吕相征,刘秀梅,杨晓光.健康人群食品过敏状况的初步调查[J].中国食品卫生杂志,2005,17:119-121.

[5]宋红霞,杨红民,黄燕萍,等.过敏性紫癜特异性IgE抗体检测及病因分析[J].中国妇幼健康研究,2006,17(6):477-479.

[7]张月战.进食螃蟹致过敏性休克[J].临床误诊误治,2008,21(8):96-97.

[8]罗良学,唐腊梅,唐发清.食物变态反应性疾病原因筛查[J].实用预防医学,2008,15(2):541-543.