TGF-β受体Ⅰ型、Ⅱ型在实验性鼠牙髓炎中的免疫组化研究

韩 杰,杨青岭,朴松鹤

(1.佳木斯大学校医院,黑龙江佳木斯 154007;2.佳木斯大学口腔医院,黑龙江佳木斯 154002)

转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)是一族具有多种生物学功能的细胞因子,对细胞的形态发生、增殖和分化过程起着重要作用,有利于胚胎发育和细胞修复,参与牙胚的发生、发展、成熟以及牙体组织的修复过程[1]。在哺乳动物,已发现7种 I型受体和5种Ⅱ型受体[2]。转化生长因子受体 (TGF-β R)包括 TGF-β RⅠ、Ⅱ、Ⅲ型3种形式。TGF-β RⅠ、Ⅱ参与了牙胚的发育及成牙本质细胞、成釉细胞的分化。TGF-β RⅠ、Ⅱ在鼠、牛以及人第三磨牙牙髓细胞、成牙本质细胞的表达均有报道[3]。本实验采用免疫组化方法检测大鼠可复性牙髓炎模型中不同时间 TGF-β RⅠ、Ⅱ的动态表达及定位情况;并探讨其在牙髓损伤修复过程中的生物学作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物和主要试剂

昆明产 Wistar大鼠 ,雄性 ,24只 ,体重 250～ 300g,购自佳木斯大学医学动物中心。TGF-β RⅠ、Ⅱ抗体,免疫组化试剂盒(武汉博士德公司)。

1.2 方法

根据不同的处死时间将24只大鼠随机分为6组。每组4只,即 0d组(正常组 )、1d组、3d组、5d组、7d组、2周组。10%水合氯醛(3mL/kg)腹部注射麻醉后仰卧固定,用备好的高速涡沦钻分别在大鼠左右上颌第一磨牙合面进行机械性不喷水钻磨,均匀磨除釉质厚度0.5mm,然后用酸蚀剂处理暴露的牙本质表面5min,正常组不做处理。各组鼠分别于0d、 1d、3d、5d、7d、 2w脱颈处死 ,迅速截取左右上颌第一、二、三磨牙连同部分颌骨标本,立即将组织块放入10%甲醛溶液4℃固定48h,经20%EDTA脱钙10 w后,流水冲洗24h,系列乙醇脱水、二甲苯置换,石蜡包埋,各标本作4 μm厚的石蜡切片 3张,1张用于 HE染色 ,2张用于免疫组化染色。免疫组化染色使用武汉博士德公司试剂盒,按其说明书操作。石蜡组织标本4 μm切片经脱蜡至水,30 μL过氧化氢液室温孵育10min,以消除内源性过氧化物酶活性。100μL正常山羊血清室温孵育 10min,倾去血清。滴加 1滴 (50 μL)1∶200稀释的TGF-β 1抗体,4℃过夜,加生物素化第二抗体,室温孵育10min。以上各步之后均用0.01mol/L PBS洗5min3次。 DAB镜下控制显色。阳性对照为乳腺癌组织,阴性对照用 PBS代替一抗。苏木素复染,中性树胶透明封片 ,观察。

2 结果

2.1 HE染色结果

1d组镜下可见血管扩张充血,水肿,压迫成牙本质细胞成扁平状,少量炎细胞浸润。3d组镜下可见血管扩张充血明显,大量炎细胞浸润,成牙本质细胞可见空泡性变。5d组镜下可见血管扩张充血,水肿,牙本质层下方可见少量修复性牙本质形成,少量炎细胞。7d组镜下可见血管充血,水肿,牙本质层下方可见大量修复性牙本质形成,少量炎细胞。2w组牙本质层下方可见大量修复性牙本质形成。

2.2 免疫组化结果

TGF-β RⅠ、Ⅱ的染色结果相似 ,0d组牙本质细胞呈阳性表达,牙髓细胞呈弱阳性表达;1 d组成牙本质细胞呈强阳性表达,牙髓细胞为弱阳性表达,3d组成牙本质细胞呈强阳性表达,牙髓成细胞为阳性表达,5d组成牙本质细胞、牙髓维细胞阳性表达,血管壁及内皮细胞可见阳性表达,7d组成牙本质细胞、牙髓维细胞呈阳性表达,至2w组成牙本质细胞、牙髓成细胞呈阳性,修复牙本质可见弱阳性表达。

2.2.1 TGF- β RⅠ 的表达

2.2.2 TGF- β RⅡ 的表达

3 讨论

3.1 TGF-β R与反应性牙本质的形成

本实验表明,3d组、5d组表现为牙髓炎急性期,TGF-β RⅠ、Ⅱ在成牙本质细胞均强阳性表达。这与 Sloan[5]的报道结果一致。TGF-β RⅠ、Ⅱ在成牙本质细胞强阳性表达,说明成牙本质细胞对 TGF-β的反应性很强,TGF-β在牙髓炎急性期期积极参与炎症因子递呈,协调免疫炎症反应平衡,保护损伤牙髓组织,刺激成牙本质细胞合成和分泌牙本质基质成份,形成反应性牙本质。研究表明,在牙髓组织炎症损伤和修复中,TGF-β抑制细菌及其毒性产物对牙髓组织造成的损伤,如激活巨噬细胞,趋化单核细胞和中性粒细胞,刺激其 LI- lβ、 TN F- α、 LI-6、 bFGF等多肽因子的表达 ,以清除和杀灭细菌及其毒素,抑制和灭活 H2O2、NO等,降低自然杀伤细胞的生成 ,限制免疫反应过度增强[5]。7 d、2w组表现牙髓炎症恢复期,TGF-β RⅠ、Ⅱ在成牙本质细胞中均阳性表达,显示 TGF-β可能参与牙髓修复过程。Tziafas等[6]研究了外源性 TGF-β 1对修复性牙本质的诱导作用,结果发现预先用 TGF-β 1中和抗体浸泡的脱钙牙本质完全失去诱导成牙本质细胞分化的活性,含 TGF-β1的 Milipore膜周围有一厚层管状基质形成,并有大量伸长极化的成牙本质细胞样细胞包绕。Hu等[7]学者用 TGF-β1进行盖髓实验也证实,TGF-β1能够诱导修复性牙本质的形成。这些研究都说明,TGF-β R在在牙髓损伤修复和反应性牙本质的形成过程中起着重要的作用。

3.2 TGF-β R与修复性牙本质的形成

牙髓作为机体内的一种特殊组织,其损伤修复机制也同样具有独特性。牙髓组织在创伤感染时,通过复杂的网络调节使未分化间充质细胞、牙髓细胞增殖、分化,分泌细胞外基质形成牙本质桥而获得自身修复的能力。这也是追求牙髓活髓保存治疗的依据。本实验表明,3d组、5d组表现为牙髓炎急性期,7d组牙髓炎症恢复期,TGF-β RⅠ、Ⅱ在牙髓细胞均阳性表达 ,比 0d组、1d组表达增强。表明这些牙髓细胞对TGF-β的反应性增强,TGF-β促进牙髓细胞增殖、分化为成牙本质细胞样细胞,替代受损成牙本质细胞,分泌修复性牙本质。本实验从 TGF-β受体角度研究,观察 TGF-βⅠ、Ⅱ受体在大鼠牙髓细胞的表达与分布情况,研究 TGF-β作为一种有效的生物活性因子,作用于成牙本质细胞和牙髓细胞表面的 TGF-βⅠ、Ⅱ受体,一方面促进成牙本质细胞分泌胞外基质形成反应性牙本质;另一方面促进牙髓细胞生长、分化为牙本质样细胞,代替受损的成牙本质细胞,形成修复性牙本质。TGF-β RⅠ、Ⅱ的表达水平可能决定着细胞对TGF-β因子的反应,从而可提高牙本质牙髓复合体的自身修复再生能力,是牙髓组织损伤修复的重要机制之一。因此,推测 TGF-βⅠ、Ⅱ受体在牙髓组织损伤修复过程中具有重要作用。

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