雷公藤多甙对体外培养的眼眶成纤维细胞增殖和透明质酸分泌的影响

常翠荣 孙丰源 于建国

(天津市宝坻区人民医院眼科 天津宝坻 301800)

甲状腺相关眼病(thyroid－associated ophthalmopathy，TAO)是眼眶常见病，其可影响患者的外观，危及患者的视力，影响患者的正常生活。该病的发病机制不清，目前认为是一种自身免疫性疾病，多数学者认为眶后成纤维细胞是TAO自身免疫的靶细胞和效应细胞。目前TAO的治疗较局限，缺乏特效的药物。本实验应用雷公藤多甙作用于体外培养人眼眶后成纤维细胞，观察其对成纤维细胞增殖和透明质酸(HA)分泌的影响，为药物治疗甲状腺相关眼病提供实验室证据。

1 材料与方法

1.1 材料 雷公藤多甙药片(中国制药厂);MTT(SIGMA);RPMI1640(GIBCO);小牛血清(hyclone);0.25%胰蛋白酶(SIGMA);0.02%EDTA(实验室配制);二甲基亚砜－DMSO(上海生工生物工程有限公司);磷酸盐缓冲液－PBS(GIBCO 0.01M，pH7.2);青链霉素(SIGMA);6孔、24孔、96孔细胞培养板(GLOSTAR);酶联免疫测定仪(BIO－RAD MODEL2550 EIA JAPAN)，CO2孵箱(美国 Forma scientific3336);B600型低速自动平衡离心机(白洋离心机厂);OLYMBUS照像显微镜由天津医科大学医学影像室提供;透明质酸放射免疫分析药盒(北京北方生物技术研究所，批号:041120);SN－695B型智能放免γ测量仪。

1.2 方法 实验标本取自海绵状血管瘤手术中切除的眶后组织，共3例。将手术过程中切除的眶后组织进行成纤维细胞的原代培养，传代，细胞鉴定，并观察不同浓度的雷公藤多甙对成纤维细胞增殖和透明质酸分泌的影响。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件，所有数据用表示，经正态分布和方差齐性检验，进行组间单因素方差分析。

2 结果

雷公藤多甙对眶成纤维细胞的抑制作用呈时间依赖性。而同一时间内，随着药物浓度的增加，抑制率(IR)增强，其对细胞的作用具有剂量依赖性和时间依赖性。雷公藤多甙对成纤维细胞分泌透明质酸也呈时间依赖性和剂量依赖性，见表1，表2。

表1 不同浓度药物组作用不同时间后的细胞增殖(±s，n=10)

表1 不同浓度药物组作用不同时间后的细胞增殖(±s，n=10)

注:同一时间，不同浓度组与对照组比较，*P＜0.05，ΔP＜0.01

分组 药物浓度(μg/mL) 24h OD值 IR(%)48h OD值 IR(%)72h OD值 IR(%)0.225 ±0.010 － 0.312 ±0.010 － 0.398 ±0.011 －实验组 0.625 0.233 ±0.011 －3.56 0.303 ±0.012 2.90 0.366 ±0.023* 8.031.25 0.191 ±0.016 15.11 0.285 ±0.013* 8.77 0.321 ±0.017Δ 19.312.5 0.137 ±0.007* 39.11 0.247 ±0.015Δ 20.90 0.228 ±0.019Δ 42.605.0 0.115 ±0.006Δ 48.89 0.189 ±0.011Δ 39.55 0.147 ±0.022Δ 63.0110.0 0.107 ±0.018Δ 52.44 0.130 ±0.021Δ 58.20 0.109 ±0.013Δ对照组072.70

表2 不同浓度药物组作用不同时间后HA的含量(±s，n=10)

表2 不同浓度药物组作用不同时间后HA的含量(±s，n=10)

注:同一时间，不同浓度组与对照组比较，*P＜0.05，ΔP＜0.01

分组 药物浓度(mg/mL)24h 48h 72h对照组0 50.10 ±13.56 61.31 ±23.55 133.30 ±5.21实验组 0.625 41.67 ±9.35 43.25 ±13.77 61.11 ±26.12Δ1.25 39.96 ±16.71 39.86 ±10.73* 49.57 ±4.50Δ2.5 39.76 ±9.34 36.26 ±2.90Δ 48.76 ±9.67Δ5.0 30.61 ±12.84* 35.18 ±5.44Δ 45.53 ±16.64Δ10.0 18.74 ±5.94Δ 30.82 ±13.83Δ 32.69 ±15.40Δ

3 讨论

目前公认的TAO发病机制为其在内、外因素作用下引起甲状腺损害，导致甲状腺抗原的释放，自身反应性T淋巴细胞被激活，激活的T淋巴细胞进入眼眶，并释放大量的细胞因子，如IL－1，IFN－γ，TGF－β，TNF等，这些细胞因子作用于眼眶成纤维细胞，使其增殖及合成糖胺多糖(GAG)，引起眼眶组织的体积增加，另一方面使免疫调控蛋白如HLA－DR，ICAM－1，HSP－72表达增强，增强眼眶局部的自身免疫反应。同时激活的成纤维细胞又可分泌多种细胞因子，其中多数为炎性分子，与眼眶浸润的淋巴细胞等分泌的细胞因子共同作用于眼眶组织，引起眼眶的炎性反应。成纤维细胞是TAO发病的靶细胞和效应细胞。在我们的实验中，应用不同浓度的雷公藤作用于眶成纤维细胞，可见其明显抑制眶成纤维细胞的增殖和透明质酸的分泌，并呈浓度和时间依赖性。雷公藤多甙具有较强的抑制CD4/CD8的功能，使CD4/CD8值下降。可能通过T辅助细胞减少，抑制T细胞增高，达到纠正T细胞亚群紊乱，使T细胞功能得到改善，由此调整免疫应答。实验也发现其有促进肾上腺合成糖皮质激素以及增加肾上腺皮质功能的作用。可减轻水肿和炎性细胞浸润，减轻血浆前列腺素E2含量和抑制肉芽组织增生。雷公藤多甙具有与糖皮质激素相似的免疫抑制作用，但无抑制下丘脑、垂体、肾上腺皮质轴的作用，故其副作用较糖皮质激素小。其临床常见的副作用为肾功能、肝功能受损，血白细胞下降，血小板减少，月经失调，精子减少，胃肠道反应，皮肤色素沉着等。雷公藤多用于多种免疫相关性疾病的治疗，如虹膜睫状体炎、葡萄膜炎、白塞病。罗燕等[1]曾观察雷公藤多甙片治疗TAO的临床疗效，结果显示，应用雷公藤多甙治疗后患者球结膜水肿消失，眼睑肿胀减轻，上、下睑回缩均有不同程度的减轻，部分患者上睑迟落消失，眼球突出度减少。B超显示各条眼外肌的厚度均有不同程度的降低。王岚[2]报道雷公藤多甙可以达到与激素治疗相当的效果，对眼球突出有较好的治疗效果，且不良反应少且轻。有报道提示雷公藤多甙小剂量多次用药较安全而且疗效较好[3]，故笔者认为在甲功正常的轻中度TAO患者中可使用雷公藤多甙以取得较好的疗效。

[1]罗 燕，郑大文，王 湘，等.雷公藤多甙片治疗甲状腺相关眼眶病变的临床观察[J].中国中医眼科杂志，2002，12(5):95

[2]王 岚.Graves眼病免疫抑制剂疗效探讨[J].浙江临床医学，2007，9(2):197

[3]李莉霞，金若敏，李化奎，等.雷公藤多甙多次给药的免疫抑制作用及安全范围的研究[J].中国新药与临床杂志，2006，25(4):248