凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）维生素B1需要量的研究

何志交 曹俊明 陈 冰 蓝汉冰 黄燕华 朱 选 陈晓瑛, 潘 庆

（1.广东省农业科学院畜牧研究所,广州510640;2.华南农业大学动物科学学院,广州510642; 3.茂名市水产技术推广中心站,茂名 525000）

维生素B1（thiam ine）,又名硫胺素或抗神经炎素,由嘧啶环和噻唑环结合而成的一种B族维生素,是动物机体维持正常生长所必需的水溶性维生素之一。在体内经硫胺素焦磷酸激酶催化后转变成为焦磷酸硫胺素（thiam in pyrophosphate,TPP）,是维持动物机体正常代谢和健康所必需的营养物质。TPP主要作为α-酮酸氧化脱羧酶（丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶）和支链脱氢酶的辅酶,参与三羧酸循环以及糖代谢过程。另外,TPP作为转酮醇酶的辅酶,参与到磷酸戊糖代谢途径中,为核苷酸的合成提供磷酸戊糖以及为脂肪酸的合成提供NADPH[1]。

到目前为止,国内外学者对水产动物的维生素B1的需要量开展了不少的研究工作。多种鱼类及软体类的维生素B1需要量已有报道,包括皱纹盘鲍[2]、草鱼[3]、鲈鱼[4]、牙鲆[5]、虹鳟[6]、斑点叉尾鮰[7]、大菱鲆[8]以及鲤鱼[9]。以上报道中,鱼类的维生素B1需要量在0.5～25.0m g/kg日粮之间,而软体类皱纹盘鲍的维生素B1需要量相对较高,为51 mg/kg日粮。但甲壳类的维生素B1需要量的研究报道相对较少。Deshim aru等[10]研究表明日本对虾对维生素B1的需要量为60 mg/kg日粮。徐志昌等[11]报道,日粮中含60 mg/kg的维生素B1时,中国对虾的增长率和存活率最高,维生素B1过量或者缺乏均会阻碍对虾的生长和代谢。Chen等[12]以生长和存活率以及血淋巴的硫胺素和TPP含量为评价指标,得到草虾对维生素B1的需要量为13～14m g/kg日粮。目前,有关凡纳滨对虾维生素B1需要量的研究尚未见报道。本文以凡纳滨对虾作为研究对象,在半纯化日粮中添加不同含量的维生素B1,观察维生素B1对其生长性能和生理生化指标的影响,确定凡纳滨对虾对维生素B1的需要量,为凡纳滨对虾配合饲料维生素预混料的配制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验日粮

以酪蛋白（不含维生素）、明胶、鱼粉作为蛋白源,玉米淀粉作为糖源,鱼油及大豆油作为脂肪源,并补充无机盐、维生素（不含维生素B1）等配制成基础日粮（表1）。在基础日粮中分别添加0、20、40、60、80、120、200和400 m g/kg盐酸硫胺素（购自上海伯奥生物科技有限公司）。经实际测定,8种试验日粮中维生素B1的含量分别为:0.83、19.70、37.40、50.80、65.30、94.20、163.00和323.00 mg/kg。另外,在基础日粮的基础上,配制1组不含有鱼粉和维生素的驯养日粮（表1）。原料经粉碎过60目筛,按配方标准称重,均匀混合后,用小型双螺杆机挤压成直径为1.0 mm的颗粒,于-20℃冰箱中保存,备用。

1.2 试验对虾及饲养管理

试验对虾取自广州虾苗厂,虾苗运回后,先在养殖系统中培育至0.50 g左右。试验前先在室内循环系统盐度为6‰的海水中用不含维生素的驯养日粮驯化暂养1周。试验开始时,取体重（0.55± 0.03）g的健康活泼的凡纳滨对虾虾苗960尾,随机分为8组,每组3个重复,每个重复40尾,分别投喂8种不同的试验日粮（分别记作G0.83、G19.7、G37.4、G50.8、G65.3、G94.2、G163、G323）。试验期间每天分别在08:30、14:30和20:00各投喂1次,投喂率为6%～17%（根据虾的摄食情况来调节投喂率,并及时捞出剩饵）。采用循环过滤水系统,养殖水源为经过活性炭过滤、消毒、稀释后的海水,盐度控制在5.0‰～6.5‰。养殖过程中不间断充氧曝气,溶解氧高于6.0 mg/L,pH保持在7.8～8.2,水温26.0～31.0℃。每日观察对虾的摄食、游动、蜕皮及死亡情况,及时捞出死虾。生长试验的饲养周期为6周。

表1 基础日粮和驯养日粮组成及营养水平（风干基础）Table 1 Com position and nutrient leve ls o f basal diet and conditioning diet（air-d ry basis,%）

1.3 样品采集及前处理

饲养试验结束时,对虾空腹24 h,称终末体重,统计死亡率。随机取5尾虾,检测虾体水分、粗灰分、粗脂肪和粗蛋白质。随机取10尾虾采血并剥离肝胰脏,采血用1m L无菌注射器自对虾头胸甲后缘围心窦入针取血,注入Eppendor f管中置于4℃冰箱,24 h后10 000 r/m in离心10m in,取上清液于-80℃冰箱中保存备用。肝胰脏取出后放入Eppendorf管中置于-80℃冰箱中保存备用。

1.4 样品分析

1.4.1 常规营养成分分析

日粮及对虾的水分、粗灰分、粗蛋白质和粗脂肪含量按照国标方法进行测定[13]。

1.4.2 生长性能计算

成活率（survival rate,SR,%）=（终末虾尾数/初始虾尾数）×100;

特定生长率（specific grow th rate,SGR,%/d）= [（Ln终末平均体重-Ln初始平均体重）/饲养天数]×100;

饲料效率（feed efficiency,FE,%）=（总体重增加量/总日粮投喂量）×100。

1.4.3 血清转酮醇酶活性（transketo lase activity, TKA）测定

血清TKA的测定采用比色法,参照Warnock等[14]和Brin等[15-16]的方法,略有改动。取50μL血清,加入等量0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.2）,充分混合后静置,再加入100μLD-5磷酸核糖（0.012 mol/L）,涡旋充分混合1 m in。然后在37℃下反应1 h,再加入100μL 15%三氯乙酸终止反应。在4℃下,6 000×g离心10 min,取上清液加入预先备好的氯化铁-苔黑酚试剂,在100℃下水浴40 min,然后用UV/V IS可见光分光度计,在580和670 nm处测定其吸光度。TKA通过Horeker[17]的方法计算,血清酶活性单位为μmo l/（h◦m L）景天庚酮糖。

1.4.4 日粮中维生素B1测定

根据GB/T 5009.197—2003,于中国广州分析测试中心采用高效液相色谱（HPLC）法测定。称取粉碎过的日粮样品2 g左右,精确至0.001 g,加入5m L 0.01mo l/L HCl,再加入20m L蒸馏水,摇匀后,于121℃加压水解30 m in,冷却后用蒸馏水定容至50 m L,用0.45μm滤膜过滤后上机检测。色谱条件,高效液相色谱仪:Agilent H p 1100,紫外检测器;色谱柱:U ltim ate column（XB-C18,5μm, 4.6 nm×250 nm）;流动相:磷酸盐溶液（1%）+乙腈（15%）+含离子对试剂的水溶液（1.776 mg/m L）;流速:1.0m L/m in;检测器:紫外波长280 nm;柱温: 35℃。

1.4.5 肝胰脏中淀粉酶活性和肝胰脏匀浆上清液总蛋白测定

肝胰脏中的淀粉酶活性采用碘-淀粉比色法测定,肝胰脏匀浆上清液总蛋白采用考马斯亮兰法测定,方法均参照南京建成生物工程研究所试剂盒测定说明书。

1.5 数据统计分析

结果用平均值±标准误（mean±SE）表示。数据分析采用SPSS 13.0统计软件,经方差分析有显著差异后再做组间Duncan氏多重比较,显著水平P为0.05。通过折线模型[18]确定维生素B1的最适需要量。模型的方程为Y=L+U（R-XLR）,其中Y是用于估计需要量的指标,R、L为折点的坐标（R,L）,R为要计算的需要量,XLR是小于R的自变量（X）值,U是直线的斜率;当X＞R时,定义（R-XLR）=0。

2 结 果

2.1 日粮中不同维生素B1含量对凡纳滨对虾生长性能、饲料效率和存活率的影响

各组凡纳滨对虾的终末平均体重、特定生长率、饲料效率和存活率见表2。凡纳滨对虾的终末平均体重、特定生长率、饲料效率在未添加组（0.83 mg/kg）最低,显著低于其他各维生素B1添加组（P＜0.05）,而其他各组间差异不显著（P＞0.05）。未添加组（0.83 mg/kg）的存活率最低,显著低于19.70、37.40、50.80和323.00 mg/kg添加组（P＜0.05）,与其他组间差异不显著（P＞0.05）。以凡纳滨对虾特定生长率为评价指标,通过折线模型分析了凡纳滨对虾的维生素B1需要量（图1）。结果显示,特定生长率（Y）与日粮维生素B1含量（X）回归方程为:Y=3.73-0.028 1×（23.9-X）（R2=0.81）,得到凡纳滨对虾维生素B1需要量为23.90 m g/kg日粮。

2.2 日粮中不同维生素B1含量对凡纳滨对虾体成分的影响

饲养42 d后,凡纳滨对虾的体成分见表3。各组凡纳滨对虾的体水分含量之间差异不显著（P＞ 0.05）;粗蛋白质、粗灰分和粗脂肪含量以未添加组（0.83mg/kg）最低,各添加组有不同程度的提高,但各组间差异未达到显著水平（P＞0.05）。

表2 日粮中维生素B1含量对凡纳滨对虾生长性能、存活率及饲料效率的影响Table 2 Ef fec ts of dietary thiam in content on grow th performance,survival rate and feed efficiency of the Litopenaeus vannamei（n=3）

表3 日粮中维生素B1含量对凡纳滨对虾体成分的影响Tab le 3 Ef fects o f dietary thiam in content on body composition of the Litopenaeus vannamei（n=3,%）

2.3 日粮中不同维生素B1含量对凡纳滨对虾血清TKA和肝胰脏淀粉酶活性的影响

由表4可见,半纯化日粮中添加50.80 m g/kg维生素B1组的血清TKA最高,显著高于未添加（0.83m g/kg）组（P＜0.05）,与其他添加组间差异不显著（P＞0.05）。凡纳滨对虾肝胰脏淀粉酶活性在未添加组（0.83m g/kg）最低,65.30 mg/kg添加组最高,比未添加组高14.24%,但各组间差异不显著（P＞0.05）。以凡纳滨对虾血清TKA为评价指标,通过折线模型分析了凡纳滨对虾的维生素B1需要量（图2）。结果显示,血清的TKA（Y）与日粮维生素B1含量（X）回归方程为:Y=30.75-0.682 6 （23.7-X）（R2=0.97）,得到凡纳滨对虾维生素B1需要量为23.70mg/kg日粮。

通过6周的饲养试验发现日粮中维生素B1的缺乏导致了凡纳滨对虾生长性能的下降。除此之外,没有发现其他明显的缺乏症状。

3 讨 论

3.1 凡纳滨对虾维生素B1需要量的确定与分析

维生素B1是水生动物机体维持正常生长和健康所必需的水溶性维生素之一。到目前为止,国内外关于水生动物的维生素B1需要量已有不少报道。在鱼类方面,Morito等[6]以生长、存活以及组织的TKA为指标,得到虹鳟对维生素B1的需要量为1mg/kg日粮。M urai等[7]研究发现斑点叉尾鮰获得最佳生长和预防缺乏症的维生素B1需要量为1mg/kg日粮。Cowey等[8]研究表明大菱鲆获得最佳生长的维生素B1需要量为0.6～2.6 mg/kg。Aoe等[9]认为鲤鱼的维生素B1需要量为0.5m g/kg。赵智勇[3]以生长、饵料系数以及肝脏维生素B1含量为评价指标得到草鱼维生素B1需要量分别为1.19、1.16和4.49 mg/kg日粮。李爱杰等[5]指出牙鲆的维生素B1需要量为18.2 mg/kg日粮。在软体类方面,Zhu等[2]以生长、肝脏TPP含量以及TPP效应为评价指标,得到皱纹盘鲍的维生素B1需要量分别为51、61和58 m g/kg日粮。在甲壳类方面, Deshimaru等[10]以生长性能和虾体维生素B1含量为评价指标,得到日本对虾维生素B1的适宜添加量分别为60和120 mg/kg日粮。徐志昌等[11]研究发现,日粮中含60 mg/kg的维生素B1时,中国对虾的增长率、存活率、淀粉酶活力以及组织中的维生素B1含量最高,维生素B1过量或者缺乏均会降低组织维生素B1含量,阻碍对虾的生长和代谢。Chen等[12]以生长、存活率以及血淋巴的维生素B1含量为评价指标,得到斑节对虾维生素B1需要量为13～14 m g/kg日粮。由以上报道可见,鱼类的维生素B1需要量在0.5～20.0m g/kg之间,软体类鲍鱼的维生素B1需要量在51～61 mg/kg之间,虾类的维生素B1需要量在13～120m g/kg之间。

表4 日粮中维生素B1含量对凡纳滨对虾的血清TKA和肝胰脏淀粉酶活性的影响Table 4 Ef fec ts o f dietary thiam in content on serum TKA and ac tivity of hepatopancreatic amy lase o f the Litopenaeus vannamei（n=3）

本试验中添加维生素B1能显著提高凡纳滨对虾的特定生长率和饲料效率,这与Chen等[12]在斑节对虾的研究中所得结果相似,表明日粮中添加适量的维生素B1能显著促进凡纳滨对虾的生长。而未添加组,可能是由于缺乏维生素B1而导致凡纳滨对虾体内糖代谢受阻,抑制了糖类正常的氧化供能以及体内脂肪的合成,导致体内蛋白质的消耗供能,从而最终导致对虾的生长缓慢。本试验中以特定生长率为评价指标,通过折线回归分析得到维生素B1的需要量为23.90mg/kg日粮。这一结果比已报道的鱼类维生素B1需要量（0.5～20.0 mg/kg日粮）要高,比皱纹盘鲍的维生素B1需要量（51～61mg/kg日粮）要低,在已报道的虾类维生素B1需要量（13～120mg/kg日粮）范围之内。不同种类的水生动物维生素B1需要量明显不同,与鱼类不同,水生甲壳纲动物由于其抱食、采食缓慢的摄食食性,日粮从投喂到完全采食,在水中浸泡的时间比较长,饲喂期间虾对日粮颗粒的选择将进一步加剧养分的溶失,包括水溶性维生素如维生素B1,因此甲壳纲动物维生素B1的需要量比鱼类高[12]。在甲壳类中,维生素B1与糖代谢有密切的关系,因此,虾类对维生素B1的需要量会因日粮中的碳水化合物的水平而变化[10]。Goldsm ith[19]认为,维生素B1作为碳水化合物代谢中丙酮酸氧化脱羧和戊糖磷酸途径的转羟乙醛酶反应中的一种辅酶,当饲喂高碳水化合物时陆生动物的维生素B1需要量升高。本试验中所用碳水化合物水平为23%,较斑节对虾的20%[12]和日本对虾的5%[10]要高,但是本试验得到凡纳滨对虾的维生素B1需要量（23.90 mg/kg日粮）,却比斑节对虾的（13～14 mg/kg日粮）[12]要高,比日本对虾的（60和120 mg/kg日粮）[10]要低。另外,试验种苗、试验日粮的组成、试验条件以及评定指标的不同都会造成所测营养需要量的差异。

在以往有关人类和老鼠的研究中表明,组织和（或）血清的TKA是发现维生素B1缺乏和评价机体维生素B1营养状况的敏感指标[15-16,20-21]。在鱼类及软体类方面,Cowey等[8]用血淋巴的TKA来评价大菱鲆的维生素B1需要量。M orito等[6]以肾脏和肝脏的TKA为指标来评价虹鳟的维生素B1需要量,并指出伴随着缺乏症的出现,TKA也出现明显的变化,因此他认为TKA是虹鳟机体维生素B1状况的较敏感指标。而在甲壳类方面,Chen等[22]以肌肉、血淋巴和肝中TKA来评估斑节对虾的维生素B1营养状况。本试验中,半纯化日粮中添加适量的维生素B1能显著提高凡纳滨对虾血清的TKA。这一结果与皱纹盘鲍[2]、斑节对虾[22],虹鳟[6]等研究结果相似。本试验以血清TKA为指标得到凡纳滨对虾维生素B1需要量（23.70mg/kg日粮）与以生长性能为指标得到的需要量（23.90 mg/kg日粮）相近,因此笔者认为生长性能指标和血清TKA是评价凡纳滨对虾维生素B1营养需要状况的合适指标。在本试验条件下,满足凡纳滨对虾最佳生长所需要的维生素B1的量为24.00 mg/kg日粮。本试验中,对虾血清TKA是根据Warnock等[14]和Brin等[15-16]方法测定的,该方法通过人为添加TPP到缺乏硫胺素的血清中,刺激血清中的转酮醇酶由无活性变为有活性,其原理可用来评价机体硫胺素的营养状况。该方法的灵敏性、可靠性以及测定过程中酶的稳定性已由始创者反复验证,并应用于临床研究。该方法也多次应用于水产研究, Zhu等[2]关于皱纹盘鲍、Cowey等[8]关于大菱鲆和Masumoto等[23]关于虹鳟的研究中都应用了该法。据此,说明该方法在测定过程中酶活稳定,可靠性高。

3.2 日粮中不同维生素B1含量对凡纳滨对虾体成分和肝胰脏淀粉酶活性的影响

对虾摄食维生素B1后,在肝胰脏中将硫胺素磷酸化而转变成为活性的辅酶,即焦磷酸硫胺素（辅羧酶TPP）。从而参与糖代谢过程中α-酮酸（如丙酮酸、α-酮戊二酸）的氧化脱羧反应,此反应是体内代谢的中间步骤,作为辅羧酶促进糖类代谢,并为糖异生、蛋白质合成、三羧酸循环等代谢途径提供部分原料,提供维持机体正常生长和发育的能量及物质需要[24]。本试验研究发现,半纯化日粮中添加维生素B1能提高凡纳滨对虾肝胰脏淀粉酶活性,在添加量为50.80m g/kg时,淀粉酶活性达到最大值,但各组间差异不显著。与此相似,许实荣等[24]关于中国对虾的研究发现,日粮中添加60 mg/kg的维生素B1能明显提高中国对虾肝胰脏的淀粉酶活性,日粮中不足或过多的维生素B1都会降低肝胰脏淀粉酶的活性。徐志昌等[11]研究发现,日粮中含有60 mg/kg的维生素B1时,中国对虾肝胰脏的淀粉酶活性最大。这表明,日粮中添加适量的维生素B1能提高凡纳滨对虾淀粉酶活力,促进糖代谢,使对虾能更好地利用日粮中的糖源。

本试验中,添加维生素B1对凡纳滨对虾体粗蛋白质、粗脂肪以及粗灰分含量均无显著影响,但有增高趋势,而且未添加维生素B1组的饲料效率显著低于添加组,这可能由于维生素B1的缺乏抑制了糖类的代谢,减少糖酵解过程所供给蛋白质和脂类合成的营养物质,最终降低了凡纳滨对虾对体内蛋白质和脂类的吸收利用,同时也减少了其他营养物质如钙、磷等的沉积[3]。

3.3 凡纳滨对虾维生素B1缺乏症

在鱼类的研究中发现,维生素B1缺乏会引起鱼类厌食、生长缓慢、出血、神经过敏、不正常抽搐、体色变暗、肌肉萎缩、失去平衡感和运动失调等症状[6-7,25-26]。而本试验中,经过6周的养殖,饲喂未添加维生素B1（0.83 m g/kg日粮）组日粮的凡纳滨对虾除生长缓慢之外,并没有发现明显的缺乏症状,这一结果与大菱鲆[8]、斑节对虾[12]以及皱纹盘鲍[2]的研究相似。Cowey等[8]和Chen等[12]认为底栖生活的鱼类和虾类长时间静置水底,不易出现像自由游动的鱼类所出现的典型缺乏症状,这个解释也适用于底栖生活的凡纳滨对虾,而且由于虾的外壳的包围,也妨碍了对虾缺乏症状的观察。另外,也可能是由于未添加组中含有的0.83 m g/kg维生素B1或对虾胃肠道合成的维生素B1足以阻止机体出现明显的缺乏症状。

4 结 论

①半纯化日粮中添加适量的维生素B1能显著提高凡纳滨对虾的生长性能和饲料效率,显著提高血清的TKA。

②本试验条件下,生长性能和血清TKA是评价凡纳滨对虾维生素B1营养需要状况的合适指标,以上述两者为评价指标,分析得到凡纳滨对虾维生素B1需要量分别为23.90和23.70mg/kg日粮。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:junmcao@163.com

（编辑 李一航）