应用重组改良型人膜联蛋白评估兔动脉粥样硬化病变程度的实验研究

宋丽萍，华子春，张 欣，轩 楠，邢海燕

（1.辽宁医学院附属第一医院核医学科，辽宁 锦州 121000；2.南京大学医药生物技术国家重点实验室，江苏 南京 210093）

急性冠状动脉综合征的发生常与一些不稳定冠状动脉粥样斑块及继发血栓密切相关。这些斑块常常并不导致严重的管腔狭窄，却容易发生破裂、糜烂、钙化等情况而易于继发血栓。因此，及时发现并干预不稳定斑块，是防治急性心血管事件的关键。大量文献报道，细胞凋亡在动脉粥样硬化的发生发展中起到非常重要的作用，而膜联蛋白V（Annexin V）可与凋亡早期细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸（phosphatidyserine，PS）特异性结合[1]。因此，用99mTc标记Annexin V可进行动脉粥样硬化（AS）病变的细胞凋亡显像的研究。重组改良型人膜联蛋白（H-Annexin V）是南京大学新药生物技术国家重点试验室对Annexin V进行重组技术的基础上，将Annexin V的N端接入一段10个组氨酸（Histidine）结构的多肽，从而构建内源性锝鳌合位点[2]，并不改变Annexin V的生物活性，同时又可提高其与99mTc结合效率及稳定性。因此，本研究就是通过99mTc直接标记 HAnnexin V，探讨99mTc-H-Annexin V检测兔AS病变的价值。

1 材料和方法

1.1 材料

实验动物：健康雄性大耳白兔9只，体重2.5~3.5kg，均由辽宁医学院动物实验中心提供。

试剂H-Annexin V由南京大学新药生物技术国家重点试验室提供。99mTcO4-由北京原子高科核技术有限公司提供。其余试剂均为国产分析纯。

仪器SPECT为GE公司生产的infinia II双探头可变角度带符合线路的SPECT。GC-911型γ计数器为合肥中佳光电仪器公司。

1.2 方法

兔AS斑块模型的制备：9只雄性大耳白兔，体重2.5~ 3.5kg。随机分为球囊损伤组、单纯高脂饲料组和正常对照组，每组各3只。

球囊损伤组给与高脂饮食 （内含2%的胆固醇和5%猪油）饲养2周后，10%水合氯醛（3ml/kg体重）静脉注射麻醉动物，腹股沟区触摸股动脉搏动，纵向切开皮肤，分离皮下组织，钝性分离股动脉、静脉和神经。切开股动脉，球囊导管插入股动脉，上行插入约30cm后，给球囊注入生理盐水0.2ml，向下拖拉球囊至髂总动脉分叉处，反复3次。缝合动脉切口和皮肤，青霉素80万单位腹腔注射3天，防止感染。术后继续给予含2%胆固醇和5%猪油的高脂饲料，15周后进行主动脉在体和离体显像。单纯高脂饲料组给予内含2%的胆固醇和5%猪油的饲料，饲喂15周。正常对照组给予普通饲料喂养15周。

99mTc-H-Annexin V的制备：取冻干品H-Annexin V 500μg以生理盐水溶解，加入缓冲液 （50mm PBS，140mm NaCl，5%甘油，pH值为7.6），再加入约40μg还原剂SnCl2，然后在其中加入37~55.5MBq/kg99mTcO4-进行直接标记，混匀，条件均为常温下震荡，37°孵化25min，取出自然冷却到室温。

99mTc-H-Annexin V标记率的测定：采用纸层析法测定标记率，取标记混合物用新华1号层析纸，丙酮作展开剂，点样后上行展开一段距离，取出晾干，然后从原点下0.5cm开始，每间隔1cm将层析纸分段剪裁，用γ计数器测定各段放射性并计算比活度。

99mTc-H-Annexin V活体兔AS斑块显像：3组兔饲喂15周后进行显像。以10%水合氯醛（3ml/kg体重）麻醉兔后固定，自耳缘静脉注射99mTc-H-Annexin V 37~55.5MBq/kg。注射后10、30min和1、2h行静态平面前后位显像。显像仪器为美国GE公司生产的infinia II双探头可变角度带符合线路的SPECT/CT仪，配低能高分辨型准直器，能峰140keV,窗宽20%。矩阵128×128，放大倍数2.0。视野包括腹主动脉、部分肝脾、双肾和膀胱。并计算2小时球囊损伤组和高脂饲料组兔降主动脉靶/非靶（T/NT）比值。

兔AS斑块离体血管显像及血管片段放射性测定：球囊损伤组和高脂饲料组兔活体显像后，注射过量的10%水合氯醛处死动物，进行解剖。小心暴露动物心脏与髂总动脉分叉之间的胸腹主动脉，清除附着于动脉上的脂肪与组织，取出降主动脉。沿腹侧纵向剪开动脉壁，以生理盐水冲洗干净后置于离体的血管按斑块的分布剪成若干等份，每段血管用电子天平称质量并用γ计数器测定放射性计数，计算每毫克组织放射性强度（cpm/mg）。

病理结果：将离体血管标本经石蜡包埋、切片，行HE染色，在光学显微镜下观察。

统计学处理：采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，所有数据用±s表示，T/NT及AS斑块的血管片段放射性摄取的比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AS模型的制备

经球囊损伤血管内皮及高脂饮食后，15周后球囊损伤组AS模型制备成功。光学显微镜下可见纤维帽形成，脂质坏死中心，细胞外基质及平滑肌细胞很少（图1）。

单纯高脂饲料组AS模型：光学显微镜下可见病变血管壁内膜增厚，内膜下泡沫细胞堆积，平滑肌细胞和基质增多（图2）。

2.2 99mTc-H-Annexin V的标记结果

标记率为95.23%~96.15%，平均为95.82%±0.28%。

2.3 兔AS活体核素成像结果

显像剂注射后10min球囊损伤组兔降主动脉可见放射性摄取，随着时间的延长，显像剂摄取增加，显像剂注射后2h，球囊损伤组兔降主动脉显影最为清晰。单纯高脂饲料组兔在注射显像剂后10min可见降主动脉放射性摄取，随着时间的延长，显像剂摄取逐渐增加，注射显像剂后2h，仍可见降主动脉影像。而正常对照组兔在注射后10min可见主动脉显影，但随着时间的延长，放射性逐渐消退，2h主动脉显影不清晰。注射显像剂后2h球囊损伤组T/NT比值（2.68±0.25）明显高于单纯高脂饲料组（2.08±0.18，t=3.26，P＜0.05）和正常对照组（1.57±0.24，t=5.44，P＜0.01）（图4~9）。

2.4 离体血管显影结果

注射99mTc-H-Annexin V后2h处死球囊损伤组和高脂饲料组兔，解剖出主动脉，肉眼可见主动脉内膜面大小不等的淡黄色斑块样突起。离体显像可见：球囊损伤组影像较为清晰，而单纯高脂饲料组可见降主动脉显影，但影像欠清晰。球囊损伤组含 AS斑块的血管片段放射性摄取为 63.33± 14.11cpm/mg，明显高于单纯高脂饲料组含AS斑块血管片段的放射性摄取52.08±12.39cpm/mg（t=2.17，P＜0.05）（图10~12）。

图10 球囊损伤组离体动脉标本显像。 图11高脂饲料组离体动脉标本显像。 图12 正常对照组离体动脉标本显像。Figure 10. The rabbit abdominal aorta atherosclerosis in vitro imaging of the balloon traumatic group. Figure 11. The rabbit abdominal aorta atherosclerosis in vitro imaging in high fat diet group. Figure 12. The abdominal aorta in vitro imaging in normal control group.

3 讨论

人膜联蛋白是钙离子依赖的磷脂结合蛋白——Annexin家族成员之一，广泛分布于机体的各种组织中，具有很多重要的生理功能。Annexin与PS具有高度亲和力，一旦细胞凋亡发生，PS就快速地再分布于细胞膜表面。凋亡开始后Annexin V与细胞的结合位点可增加100~1000倍左右，因而Annexin V是细胞凋亡非常敏感的指标[3]。由此，放射性标记的Annexin V最早被研制成细胞凋亡显像剂，用于活体监测及定量测定细胞凋亡。在动脉粥样硬化斑块组织中，内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞及淋巴细胞都存在着凋亡现象。而细胞凋亡与不稳定斑块密切相关，但有研究显示在动物早期的动脉内膜病变中，发现了平滑肌细胞的增殖和凋亡[4]。由于动脉粥样硬化病变的不同阶段存在的凋亡细胞数量不同，因此用放射性核素标记的Annexin V可进行动脉粥样硬化病变程度的评估。Johnson等[1]报道，99mTc-Annexin V在猪动脉粥样硬化模型中显示冠状动脉的斑块，免疫组化结果提示，病变动脉段的细胞凋亡率明显高于周围正常动脉段及对照组的动脉段。同时，Buck等[5]体外放射性核素显像表明，99mTc-Annexin V的摄取量与主动脉粥样硬化部位血管损伤的严重程度、巨噬细胞凋亡的数量成正相关。

动脉粥样硬化模型的制备方法有很多，由于家兔在脂代谢方面与人类有一些相似之处，是研究AS常选的实验动物。采用单纯高脂饲料喂养兔诱发AS的实验模型，数月就能形成早期的AS病变[6]。而通过球囊损伤动脉并给予高脂饮食可造成不稳定斑块模型[7]。本实验单纯高脂饲料组AS模型在光学显微镜下可见病变血管壁内膜增厚，内膜性泡沫细胞堆积，平滑肌细胞和基质增多，为AS早期病变。球囊损伤组兔经球囊损伤血管内皮及高脂饮食后15周在光学显微镜下可见纤维帽形成，有大量的脂质坏死中心，而细胞外基质及平滑肌细胞很少。根据美国心脏病协会将动脉粥样硬化的组织形态学变化分型可知，球囊损伤组兔动脉粥样硬化模型为晚期病变纤维粥样斑块期。

有研究报道：多种核素曾被用于标记Annexin V，包括99mTc、123I、124I、125I、18F等，而99mTc制备容易、 价格低廉， 适合SPECT显像[8-9]。然而，直接用99mTc标记的Annexin V将产生一些变性蛋白，且标记率较低。以HYNIC结合放射性核素的方式标记率高，但标记过程较直接标记法复杂，肾脏的摄取高。H-Annexin V是在Annexin V的生物结构中寻找活性区域并进行克隆得到的保持甚至于超过Annexin V生物活性的一种多肽，既保持了Annexin V对于PS的强亲和力，又引进了更多的结合位点，提高了其与99mTc的结合效率及稳定性，而且标记方法更加简单，稳定性好[10]。

因此，本研究尝试应用99mTc标记重组改良型H-Annexin V进行兔AS病变程度评估的显像研究，可见球囊损伤+高脂饲料组AS血管对99mTc-H-Annexin V的摄取明显高于单纯高脂饲料组及正常组的血管，显像结果良好。AS血管标本的离体显像及其片段的放射性摄取测定显示：球囊损伤组影像较为清晰，而单纯高脂饲料组可见降主动脉显影，但影像欠清晰。球囊损伤组含AS斑块的血管片段放射性摄取明显高于单纯高脂饲料组含AS斑块血管片段的放射性摄取。说明随着动脉粥样硬化病变程度的加重，AS部位细胞凋亡增多，病变部位99mTc-H-Annexin V的摄取也明显增加，因此，99mTc-H-Annexin V可用于无创检测AS斑块并评估病变的严重程度。

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