食物中过敏原检测技术研究进展

郑义成，华 萍， 杨安树,*，刘 波，陈红兵

食物中过敏原检测技术研究进展

郑义成1,2，华 萍3， 杨安树1,2,*，刘 波1,4，陈红兵1,2

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047；3.江西省食品工业研究所，江西 南昌 330029；4.江西中医学院药学院，江西 南昌 330004)

食物过敏已经成为全球性的食品安全问题，而由其引起的疾病严重影响了人们的正常生活，因此开展食物中过敏原的检测研究显得尤为重要。本文综述当前用于食物中过敏原检测的常见方法和新兴检测技术，并探讨食物中过敏原检测方法的发展前景。

食物过敏；过敏原；检测技术

食物过敏是人们对食物产生的一种不良反应，属机体对外源物质产生的一种变态反应，已经成为一个全球性的食品安全问题。流行病学调查表明全球范围内有1%～2%的成年人对食物过敏，而小于3岁的婴幼儿中有8%以上对食物过敏[1]。另一项调查则显示食物过敏反应对5%的儿童和3%～4%的成年人产生危害，并且患病率呈逐年增加的趋势。食物过敏是诱导皮肤疾病、肠道及呼吸道等多种症状的重要原因[2]。以发达国家为例，在美国，每年约125000例急诊患者中有53700例的发病是由于食物过敏引起的[3]。据统计，近年来，我国食物过敏的发病率高于其他国家，因此，应高度重视由食物过敏引起的食品安全问题。

1 食物中过敏原检测必要性

食物中过敏原是指包含在食物中引发或激起过敏反应，并引起过敏现象的食物成分。在正常的情况下，人体的免疫系统会产生抗体用来保护自身不受外来有害物质的侵害。问题是，一些过敏者的身体却会将正常无害的物质误认为是有害的物质，并通过免疫应答产生抗体，此时，这种外来物质就成为一种“过敏原”。能引起部分人群过敏的食物有多种，已有160多种食物被确认为具有过敏原性，广泛的分布于农作物、畜禽产品和水产品中，其中牛乳、鸡蛋、鱼、贝类、花生、大豆、坚果以及小麦是主要的过敏原来源。随着食品加工技术的发展和生活水平的提高，人们经常对食物进行各种深加工，如加入食品添加剂、防腐剂或者利用转基因生物为原料生产大批食品[4]，这些加工方式在改善食品功能特性的同时可能会造成食物过敏性的改变甚至形成各种新的过敏原[5]。

食物过敏现象越来越普遍，它能引起急性或慢性疾病。可以说，食物过敏已经严重地影响了部分人群的生活质量甚至危及生命，国际上有关食物过敏事件的报

道屡见不鲜。目前，临床上治疗食物过敏症最有效最直接的方法就是避免食用含有过敏原的食物，这就要求生产商在食品标签上正确标示出导致过敏的成分，以免消费者因不知情而误食引起过敏。因此，避免食物过敏的首要任务是对其所含的过敏原进行检测，以便于食品的风险评估、加工、管理以及致敏性成分的标示。国内外已研究和开发出多种食物中过敏原检测技术，本文就这些检测技术的进展作一综述。

2 食物中过敏原常见检测分析技术

食物过敏原的检测可分为体内诊断和体外检测。体内诊断主要利用皮肤敏感实验或双盲对照食物激发实验等手段评价过敏人群是否对食物过敏以及对哪些食物过敏原产生过敏反应。而针对食物中过敏原检测主要是体外检测技术，常见体外检测食物中过敏原技术主要有两大类：一类是基于蛋白质水平的检测方法[6-7]；另一类是基于DNA水平的检测方法，如PCR和实时荧光PCR (RT-PCR)技术[8]等。

2.1 基于过敏原蛋白的检测方法

2.1.1 酶联免疫吸附技术

酶联免疫吸附技术(ELISA)是在酶标免疫原理基础上发展起来的，用酶标记抗体或抗抗体进行抗原抗体反应，并以酶作用底物后的显色深浅来反应待测样品中抗原或抗体的含量。目前商业产品中过敏原蛋白的检测大多采用ELISA试剂盒。但是在食品加工过程中，由于交叉污染或者加工容易造成过敏性蛋白变性或结构改变，影响着过敏原检测的准确性。针对这一问题Watanabe等[9]建立了以含有SDS、表面活性剂、2-巯基乙醇和还原剂为缓冲液的ELISA方法检测过敏原，此法能使相关过敏原复性程度提高10到100倍，可用于检测加工过程中已变性的蛋白过敏原，拓宽了食品中过敏原的检测范围。ELISA方法检测的灵敏性与所选用的抗体有关，过敏原单克隆抗体的应用有助于提高检测的灵敏性和特异性。Ma等[10]建立了基于单克隆抗体的竞争ELISA法用于检测大豆中主要过敏原大豆球蛋白，该法灵敏度高，检出限为0.3ng/mL，线性范围内重复性很好，并可评估饲料及食品中的大豆过敏原。除检测单一过敏原外，在ELISA法基础上发展了同时检测食物中多种过敏原的方法，张在军等[11]利用斑点ELISA法 (Dot-ELISA)对花生、鸡蛋清和虾中过敏原的检测进行了研究，结果表明Dot-ELISA法可以同时测定多种过敏原，且具有简便、快速、特异、灵敏、重复性好、成本低等优点，可作为食品过敏原鉴定与评价的新方法。

ELISA法灵敏性高、特异性强、快速、费用低，因而在过敏原检测中得到了广泛的应用，特别适用于食物中少量存在就能引起严重过敏症状的过敏原检测。但是ELISA检测方法的局限性在于难以适用于基因改良食品中过敏原的检测[12]。另外，由于样本、试剂以及操作等因素造成检测中容易出现假阳性结果。

2.1.2 免疫扩散技术

由抗原抗体沉淀反应派生出的检测方法很多，其中免疫扩散技术是最常用的方法，其基本原理是以半固体的琼脂凝胶作为介质，将可溶性抗原或抗体溶于凝胶中进行琼脂扩散或免疫扩散。免疫扩散技术包括用于定量分析的单向琼脂扩散和用于定性分析的双向琼脂扩散。为了提高扩散速度和检测灵敏度，将扩散技术和电泳技术相结合发展了对流免疫电泳和火箭电泳等技术。对流免疫电泳利用通电后接通负极的抗原带负电，进而在琼脂糖凝胶平板中向着接通正极的抗体移动形成沉淀，但是灵敏度低，与之相比，火箭电泳的灵敏度高些。Malmheden等[13]用火箭免疫电泳检测不同食物中乳蛋白含量，灵敏度为30mg/kg。该课题组利用此技术进一步对各种食品如鸡蛋、牛奶、榛实和花生中蛋白过敏原进行了检测[14]。为了提高此法检测的灵敏性，金丹等[15]将酶联免疫分析与火箭电泳相结合，利用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体混合于琼脂糖凝胶中进行火箭免疫电泳，电泳后得到的免疫沉淀峰具有酶活性，加特异底物使得沉淀峰着色清晰可见，通过绘制标准曲线来实现过敏原的定量分析。火箭电泳较简单的免疫扩散所需时间短、误差小、精密度高，但每块板检测样品数较少。总体来说，免疫扩散技术原理简单、费用低，但在实际操作过程中制胶和染色的操作复杂、重复性差、影响因素多。此检测方法的进一步提高依赖于相关技术和仪器的改进。

2.1.3 化学发光免疫分析技术

化学发光免疫技术(CLIA)是将高灵敏性的化学反应发光技术与高特异性的免疫测定技术结合起来，利用发光系统指示抗原抗体反应以检测抗原或抗体的一种方法[16]。CLIA既可单独也可结合其他方法用于检测过敏原、抗体和半抗原[17]。例如Scheibe等[18]在巧克力糖果榛实和杏仁蛋白微量过敏原的跟踪检测分析研究中，将化学发光技术与免疫印迹方法相结合，提高了检测方法的灵敏性，最低检测限为5mg/kg。CLIA法可广泛应用于鉴定食品中过敏原的含量，以验证食品标签中过敏原含量的真实性[19]。Faeste等[20]利用时间分辨荧光免疫分析技术对巧克力、甜饼干等食品中能引起过敏症的榛实蛋白进行测定，实验选用独特的铕螯合荧光抗体来进行检测，降低了待检样品基质干扰，提高了检测的灵敏度，最低检出限为0.1mg/kg，榛实蛋白检出量为0.33mg/kg。CLIA具有无辐射、标记物有效期长并可实现全自动检测等优点，检测食物中过敏原的灵敏度比ELISA法高1000倍，在食品标签中标示过敏原种类及含量方面具有

优势，有望逐步取代放射免疫和普通ELISA检测的趋势，是免疫检测技术重要的发展方向之一。

2.2 基于过敏原DNA的检测方法

蛋白质水平的检测方法直接，但是当过敏蛋白含量极低时，很容易被食品的基质所掩盖，同时不同过敏原之间有部分相同的抗原决定簇会发生一定的交叉反应，造成检测的误差。DNA水平的检测技术是通过检测是否存在过敏原蛋白基因来衡量过敏原的存在。相比之下，DNA的特异性较高，且比蛋白质更耐加热和加压处理。目前主要用于一些含量很低或者成分复杂食品中过敏原的检测。

2.2.1 聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应技术(PCR)是一种敏感特异的检测核酸分子的定性方法，其原理类似于DNA的天然复制过程，特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，根据PCR扩增核酸的情况来检测DNA。无论对于加工或未加工的食品，PCR方法已经成为一种标准化的过敏原检测方法，Yano等[21]运用传统的PCR方法对已加工食品中植物类过敏原胡桃的残留进行了检测。Hirao等[22]采用PCR方法对食品中可能导致过敏的荞麦DNA含量进行了检测，检测限可达到1mg/kg。PCR方法的优点在于热变性条件下目标DNA可以有效提取而不像蛋白提取时受食物基质的影响较大，同时稳定性好，检测速度较快；不足之处在于PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，需要多种仪器，实验过程繁杂，容易造成污染和出现假阳性的结果。

2.2.2 实时荧光定量PCR技术

将传统PCR检测模式中的PCR扩增和荧光标记探针检测相结合来检测目的核酸的技术称为实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)。该技术通过在PCR扩增过程中检测产物的荧光信号达到实时监测整个PCR进程，通过实时荧光PCR方法可快速、准确地检测出食物中过敏原成分基因，从而判断食品中是否存在过敏原[23]。在农作物中过敏原检测方面，王殿夫[24]运用此方法对花生和芹菜中过敏原成分进行了检测，检测结果表明，该法特异性强、灵敏度高，对花生和芹菜中相关过敏原检测限分别为3.6pg DNA和4.0pg DNA。董薇等[25]采用RT-PCR技术建立了对芝麻中过敏成分的快速检测方法，实验中对照组并无交叉反应，检测限可达1mg/kg。在已加工食品中过敏原检测方面，Hupfer等[26]采用RT-PCR法对面包屑、大米饼干中能引起过敏反应的芝麻成分进行了检测，检测限为10mg/kg。而在海产品中过敏原检测方面，Lopez 等[27]运用RT-PCR法对海产品中食入性过敏原——异尖线性寄生虫进行了检测，检测限达40mg/kg，这是目前该过敏原的最低检测限。实时荧光定量PCR技术与常规PCR相比，实现了由定性到定量检测的飞跃，具有特异性强、灵敏度高、自动化、重复性好、定量准确、全封闭反应，大大拓宽了DNA检测方法的应用范围。

3 食物中过敏原新兴检测技术

3.1 量子点荧光标记技术

量子点，又称半导体纳米微晶粒，粒径在1～100nm之间，主要由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素组成，量子点接受激发光后能够产生荧光，可以作为一种荧光探针[28]。与传统荧光染料相比，量子点激发光光谱宽且连续，发射光谱窄、对称、重叠小，有利于提高检测的选择性和灵敏度；具有尺度效应，可通过控制量子点的大小、组成来调谐其发射波长；荧光强度高、稳定好，可实现较长时间分析检测[29]。根据量子点的多色性即荧光颜色可由其大小及材料来调节，利用不同荧光的量子点标记不同抗体，再用免疫学方法在一种激发光作用下可同时检测多种抗原，提高了检测效率，达到高通量检测的目的。目前，基于量子点标记技术在检测农药残留及致病菌方面的研究较多，但是在食物中过敏原的检测方面还相当缺乏，如将量子点作为荧光探针标记过敏原抗体，通过抗原抗体反应，以荧光强度来定性或定量检测相应的过敏原。由于激发食物过敏反应的阈值具有个体化差异，加之过敏食品中过敏成分复杂，一些过敏性食物中存在多种过敏原，因此，研究和开发基于量子点标记的多元检测食物中过敏原的方法是未来重要的发展方向。

3.2 生物芯片技术

生物芯片是指通过微电子、微加工技术在芯片表面构建的微型生物化学分析系统，广泛应用于基因测序、疾病诊断、药物筛选、致病菌检测等方面。目前，生物芯片技术逐渐进入了食品安全检测领域，已研制出了快速检测食品中致病菌的生物芯片技术，此法检测时间短，可同时检测多种致病菌，操作简单、灵敏度高、重现性好。用于过敏原检测的生物芯片主要是蛋白芯片，利用荧光标记的灵敏性和抗原抗体结合的特异性来实现检测。Harwanegg等[30]建立了以生物芯片免疫分析为基础的过敏原微阵列技术对鸡蛋、牛奶特异性IgE进行检测，而Heyries等[31]则采用微流控生物芯片技术对过敏原特异性抗体进行化学发光分析检测。生物芯片技术应用于食品安全检测，具有快速、微型化、自动化、高通量、高特异性、高灵敏度等优点；但是，检测成本高，芯片上多种探针的存在容易造成假阳性的结果。尽管存在问题，其发展前景仍然十分广阔，将生物芯片用于食物中过敏原的检测有助于加强食品质量监管的力度，确保食品安全[32-33]。

3.3生物传感器技术

生物传感器是一类对生物物质敏感并将其转换为光、声、电等信号进行检测的特殊传感器[34]，由分子识别部分和转换部分组成。待检测物质经扩散进入生物材料后会发生相应的生化反应，而分子识别部分能识别反应的信息，并由转换部分转化成各种信号经仪表放大并输出实现检测。生物传感器的种类很多，如微生物传感器、DNA传感器、酶传感器和免疫传感器等，广泛的应用于发酵工业、医学、环境监测以及食品工业中。用于食物中过敏原检测的生物传感器为免疫传感器，利用抗原抗体的特异性结合检测信号。目前国内很少利用生物传感器来检测食物中过敏原，而国外利用此方法检测食物中过敏原较多，如Maria等[35]用生物传感器对橄榄油中掺杂的能引起过敏的榛实蛋白进行了检测，检测限为0.08μg/g，灵敏性比ELISA法低。生物传感器专一性强、分析速度快、准确性高、成本低，但是它的使用寿命较短，稳定性以及制备的复杂性制约着商业化和批量生产。目前采用生物传感器对食物中过敏原进行检测已经成为一种强有力的分析工具[36]，也是过敏原检测发展的重要方向。

4 展 望

民以食为天，食品安全关系到广大人民群众的切身利益，而食物中过敏原的检测在食品安全领域具有重要的地位，而有关这方面的检测技术发展迅速。目前，无论是常用的检测方法还是新兴的检测方法，它们在检测食物中过敏原方面都有各自的优点和不足，而将多种方法结合能更有效的检测常见食物中过敏原甚至是一些潜在过敏原[37-38]。在我国，虽然已有一些针对食物中过敏原的检测方法，但有关食品中过敏原检测的研究缺乏理论基础，加之制造工艺及核心技术的欠缺，开发应用“高精尖”过敏原检测技术还有不少难度。已采用的过敏原检测方法，大多在灵敏性、重现性、复杂性等方面存在一定的局限性。如应用较多的针对鸡蛋、牛奶、花生、小麦等食品过敏原的ELISA检测试剂盒，重现性差、耗时长，一次仅能检测一种过敏原。随着贸易全球化的发展，不同地域间食物的相互流通以及深加工技术的广泛应用使得过敏人群接触食物中过敏原的种类日益增多，因此，开发高通量检测食物中多种过敏原的技术显得越来越重要。同时，要结合生物信息学分析、免疫血清学检测、动物/细胞致敏模型的建立等手段开展多级评价模式。总之，伴随着食品生物技术的突飞猛进，未来食物中过敏原检测将向准确、安全、经济、快速、普遍适用、高灵敏性的检测方向发展。

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Research Advance in Detection Technologies for Allergen in Food

ZHENG Yi-cheng1,2，HUA Ping3，YANG An-shu1,2,*，LIU Bo1,4，CHEN Hong-bing1,2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. Jiangxi Food Industrial Research Institute, Nanchang 330029, China；4. Department of Pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China)

Food allergy has become one of the global food safety problems, and the diseases originated from food allergy reaction is seriously affecting human life, so it is especially important to detect the allergen in food. In this paper, the commonly used technologies for the detection of allergen in food are reviewed briefly. Meanwhile, the future development is also discussed.

food allergy；allergen；detection technology

TS201.6

A

1002-6630(2010)21-0417-05

2010-06-28

江西省教育厅科学技术研究项目(赣教技字[2007]48号)；江西省农业厅农牧渔业科研项目(赣农字[2008]66号)；南昌大学食品科学与技术国家重点实验室开放基金项目(SKLF-KF-201007)

郑义成(1985—)，男，硕士研究生，研究方向为粮食油脂与植物蛋白工程。E-mail：whywan10000@163.com

*通信作者：杨安树(1972—)，男，副教授，博士，研究方向为食品质量与安全。E-mail：yanganshuxjh@yahoo.com.cn