牛结核病检测诊断技术研究进展

宋振忠，钟旗，徐志光，许礼义，呼西旦

（新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000）

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium)引起的人、畜、禽共患的一种慢性传染病，由人结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌(MB)、禽型分枝杆菌(M, avium)、非洲分枝杆菌以及田鼠分枝杆菌（M,microti）所引起，统称这些病原为结核分枝杆菌复合物(或群)。

目前已知，结核病除感染人外还能使50多种哺乳动物和25种禽类感染，牛是最敏感的动物。牛结核主要由牛分枝杆菌引起，人结核的10%以上由牛分枝杆菌引起。每年，世界上大约有3百万人感染牛结核杆菌造成结核病。中国是世界上感染结核病较高的22个国家之一。由于牛和人类的关系(牛奶、牛肉及耕牛等)较其他动物更为密切，因此，牛结核又是任何其他动物结核病最大的传染源。其传染和流行严重地影响到畜牧业的持续健康发展，不仅可以造成奶牛乳房炎、结核性胸膜炎等疾病，还能造成牛奶产乳率和乳质下降，更严重威胁着人类的身心健康。牛结核病被国际兽疫局定为B类传染病，我国将其列入二类动物疫病。

结核分枝杆菌按其致病力可分为3种型，即人型、牛型和禽型，三者有交叉感染现象。牛型主要侵害牛，其次侵害人、猪、马、绵羊和山羊等，在所有牛种中奶牛最为易感。牛分枝杆菌共可感染50多种哺乳动物。

本病无季节流行性，一年四季均可发生，在农村主要以散发为主，规模化养牛场主要以区域性流行为主。牛结核病的潜伏期一般为16～45 d，或者更长，通常为慢性。在感染初期几乎不表现出特有的临床症状。感染一段时间后，一般日渐消瘦，精神不振，频频咳嗽，毛粗无光，皮肤失去弹性，食欲不振，产奶量下降等临床症状。由于牛感染结核病的经过往往比较缓慢，根据动物患病器官的不同，表现出的临床症状也各不一致。牛结核病的临床症状主要分为以下几种类型：肺结核、乳房结核、肠道结核、淋巴结核和生殖结核等。

目前，在结核病的监测和诊断中，普遍采用结核菌素皮内实验（TT）、细菌痰涂片、细菌的分离培养等传统的技术。随着科学技术的进步，免疫学和分子生物学技术有了很大的发展，出现了很多适合结核病检测的先进技术，本文就对这些新老技术进行简要的概述。

一、检测诊断技术的概述

（一）细菌学检测技术

1.结核杆菌的生物学特征。结核杆菌大小为0.2～0.5 μm×1.5～4.0 μm，两端钝圆，无芽胞和荚膜，无鞭毛，不运动，革兰氏染色呈阳性。人型结核杆菌细长而稍弯曲，牛型略短而粗，禽型小而粗，而且略具多形性。本菌由于细胞壁中含有大量的糖脂，普通的染色方法很难使其着染。通常采用萋尔-尼尔逊抗酸染色法进行染色，抗酸杆菌呈特征性的红色，而其它细菌和细胞呈蓝色。

2.结核杆菌的培养特性。通常采集患病动物的尿液、痰、胸水、腹水、脓液或伤口分泌物和肺、淋巴结等有典型钙化灶的病变器官进行细菌的分离培养。本菌为专性需氧菌，对营养要求严格，常用罗杰二氏培养基、改良的罗杰二氏培养基、丙酮酸培养基和小川培养基培养。最适生长温度为37℃～37.5℃。本菌生长缓慢，特别是初代培养，一般需10～30 d才能看到菌落。其生长速度依次为禽分枝杆菌，结核分枝杆菌，牛分枝杆菌。菌落粗糙、隆起、不透明、边缘不整齐，呈颗粒、结节或花菜状，乳白色或米黄色。在液体培养基里，因菌体含类脂而具疏水性，形成浮于液面有皱褶的菌膜。传统的结核杆菌临床诊断一般依赖于细菌学方法，其中痰涂片抗酸染色法快速，但灵敏度低，特异性差，需要观察者有丰富的经验积累，且至少需要有大于5×106/L的细菌才能检测到阳性结果，而且无法区分MTB和非MTB感染，同时不能区分死菌和活菌。此方法培养时间较长(至少2个月)，已很难满足生产与生活的需要。但是不论是何种检测技术最终的完全确诊还要以罗杰(L-J)固体培养法为金标准。

（二）免疫学检测技术 结核分枝杆菌是细胞内寄生菌，因此机体抵抗结核分枝杆菌的感染主要依靠细胞免疫。在机体感染了结核分枝杆菌后，最早在机体内引起的是细胞免疫；而体液免疫是随着感染时间的延长而缓慢的增强；细胞免疫在结核杆菌感染的后期又不表现出来，所以要准确的判断动物所处的感染期，以采用合适的检测方法。

1.结核菌素皮内试验（TT）。用各种提纯的结核菌素（PPD）皮内注射动物，一段时间后根据皮厚差来判断结核病的一种方法。目前该方法被世界各国广泛采用，并且是世界动物卫生组织OIE推荐的诊断牛结核病的唯一方法。该方法检出率和准确性都比较高，但用该方法不能区分致病性分枝杆菌和非致病性分枝杆菌感染，更不能区分致病性结核杆菌的型、在用BCG免疫的地区或国家，不能区分自然感染和免疫个体、对感染严重的个体有可能出现假阴性的结果、在一段时间内（30 d），由于迟发性变态反应（DTH）不能重复进行、必须进行严格的质量控制，否则严重影响结果。同时此技术操作要求较高，主观性比较大，不能进行大规模的流行病学调查。

2.间接ELISA法（iELISA）。根据抗原在固体支持物上的吸附性及抗原抗体的特异性与酶的高效性的原理而设计的方法。该方法简单易行，无需特殊精密仪器；能够大规模的进行流行病学调查，且具有高特异性高敏感性的特点，所以在结核病血清学诊断方面研究最多，目前该方法主要作为PPD的一个补充。但该方法由于观察对象不同、检测使用抗原不同、质量控制困难等影响了该实验的结果，导致其结果差异较大。早期采用PPD作为检测抗原，随着分子生物学和基因工程技术的发展，大量的蛋白在体外获得并用于诊断抗原的研究。该方法较PPD-ELISA具有更高的特异性，但敏感性有所下降。据报告，ELISA法检测结核抗体的敏感性为62.0%～94.7%，特异性为91.2%～94.0%。因此，目前此法仍不失为结核病、特别是肺外结核诊断中有价值的实验室诊断方法之一。

3.免疫斑点测定法。即以硝酸纤维膜代替免疫滴定板，以特异的结核菌抗原致敏结合在纤维膜带上，再与检测血清反应，继之以酶标记的抗牛IgG偶联反应后进行显色反应，用肉眼或光密度计与标准斑点比较，此法更易施行。有人认为可作为初筛试验。目前已有商品采用胶体金与蛋白质A结合物代替酶与第二抗体偶联，可在数分钟至20 min内完成。

4.免疫印迹法。是利用SDSPAGE技术与酶的高敏感性相结合的技术。首先用SDS-PAGE把蛋白按分子量分开，再把分开的蛋白转移到硝酸纤维膜上，用检测血清来进行中和反应。继之以酶标记的抗牛IgG偶联物，再加底物显色，观察结果进行分析。此法过于复杂，但有助于新抗原的鉴定研究。陆学东等以此技术检测496例结核病，610例正常人及非结核病病人的血清，其敏感性90%，特异性96%。优于同时进行的ELISA法。作者还发现30～43KDa多肽成分是主要的诊断抗原成分。

5.淋巴细胞增生实验。致敏的外周血淋巴细胞（PBLC）在特异性抗原的刺激下，可使抗原特异性T淋巴细胞亚群发生增生性反应。然后用同位素或5-溴脱氧尿苷标记，配合流式细胞仪，可对其进行识别和计数。通过测定外周血循环中的增生淋巴细胞的比例可了解淋巴细胞增生的程度，间接反映淋巴细胞被特异性抗原致敏的情况，从而分析动物机体对结核杆菌的细胞免疫状态。该方法试验耗时而且前期准备以及试验操作都比较复杂，比如需要较长的孵育期和要使用放射性核苷酸，所以在常规的牛结核病诊断中并不被采用，而仅仅用于野生动物以及动物园动物的检测。

6.IFN-γ检测法。IFN-γ又称Ⅱ型干扰素，是一种由CD4+TH1、CD8+T型细胞以及NK细胞产生的细胞因子，它不仅具有Ⅰ型IFN(α-干扰素、β-干扰素)的抗病毒和抗肿瘤活性，更重要的是还具有促进MHCⅡ类抗原表达、增强APC细胞与T细胞的相互作用、增强T细胞辅助抗体产生和细胞毒性T细胞产生的能力等诸多免疫调节活性。其原理是当从感染牛获得的致敏淋巴细胞再次遇到牛提纯结核菌素(主要是MTB特异性的蛋白抗原，如ESAT-6、CFP-10)，可以在体外模拟延迟型过敏反应(DTH)，从而使得致敏淋巴细胞释放相对大剂量的γ干扰素。而γ干扰素可以用IFN-γ的免疫学检测方法检测到，没有感染的牛，其淋巴细胞再次遇到抗原时，并不释放γ干扰素。因此，检测到γ干扰素与牛型结核分枝杆菌的接触具有相关性。检测方法是将试验牛的血液淋巴细胞培育，加入特异性的抗原一起孵育16～24 h，致敏的淋巴细胞释放出IFN-γ，以IFN-γ-ELISA进行定量测定。

体外IFN-γ释放反应除特异性较高外，还有以下一些优点，结果较为客观，24～48 h可完成，不会激发记忆性免疫反应。但其最大的缺点是价格昂贵，因而短时间内较难普遍推广。γ-干扰素测定法的广泛性田间试验己在世界上许多国家(包括澳大利亚、爱尔兰、新西兰、阿根廷、西班牙、意大利和美国)完成，并在澳大利亚和新西兰被认可为正式试验。目前已有20多万头经过测试，本法敏感性为77%～93.6%，而相对于PPD试验的敏感性为65.6%～84.4%，特异性为98.1%。

（三）分子生物学检测技术

1.结核杆菌的基因组特征。牛分枝杆菌AF2122/97基因序列全长4,345,492 bp，其中GC含量为65.63%，含有3952个编码蛋白的基因，一个噬菌体和42个插入元件。其基因组在核酸水平上与人型结核分枝杆菌有大于99.95%的同源性，二者之间表现出明显的线性相关,但并未表现出广泛的易位、重复或翻转。在牛结核分枝杆菌基因组中有11处基因缺失，大小范围为1～12.7 kb。

研究发现，人型复合分枝杆菌(包括人结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、非洲型分枝杆菌以及田鼠分枝杆菌)中存在一些插入序列(IS)可作为探针用于结核病的诊断,同时采用限制性酶切片段长度多态性(RFLP)技术对人型复合分枝杆菌能进行种水平的鉴定分型研究。研究最广泛的是与肠杆科中插入片段相类似的插入基因片段,包括IS6110,IS986和IS987。这些基因片段都只存在于人型复合分枝杆菌中, 并以多拷贝形式出现。近年发现人型复合分枝杆菌中还含有第二类插入序列IS1081,它与IS6110极为不同, 但与金黄色葡萄球菌中IS256相似。IS1081也只存在于人型复合分枝杆菌中,拷贝数为6个。

2.用于结核病检测的主要分子生物学技术。用于结核病的诊断技术主要有核酸扩增技术、基因探针技术、PCR与基因探针相结合的技术、DNA指纹图谱检测法、基因测序法和生物芯片技术等。

(1)核酸扩增技术。PCR是一种根据核酸复制原理采用分子技术模拟细胞内核酸复制过程的DNA或RNA体外扩增技术。1989年,Hance等最先报道将PCR技术应用于结核分枝杆菌（TB）的检测。PCR检测方法的突出特点是灵敏度高,可以检测出1～100 fg纯化的分枝杆菌DNA, 相当于1～20个MTB, 与传统的痰涂片抗酸染色和MTB培养方法相比,其敏感性得到了大大提高。此外, 与传统检测方法相比,PCR检测的报告周期短, 1～2 d即可发出报告, 因此对于TB的早期诊断具有独到的优势。

(2)基因探针技术。基因探针能识别特异核苷酸序列的带标记的核酸分子，也就是分子杂交。采用放射性同位素和地高辛、光敏生物素、化学发光和荧光等非同位素标记。目前已建立了菌落杂交、斑点杂交、微孔板杂交和原位杂交等方法。DNA探针技术最大的优点是高的特异性，但敏感性并不是很理想，多数探针只能检出106个细菌/L以上的标本，需依赖纯培养，因此受到很大限制。张玲霞等研究表明，DNA探针直接用于TB患者痰标本的阳性率为22.2%，低于涂片抗酸染色检查。

(3)PCR与基因探针相结合的方法。PCR方法与基因探针技术的结合一方面可以克服探针技术敏感性不强的缺点，另一方面，核酸探针的引入可消除很大一部分PCR因非特异性扩增带来的假阳性结果。因此，这两者的结合同时具备了高度敏感和高度特异的特点，代表了TB分子生物学诊断发展的一个主要方向，是目前TB分子生物学诊断方法中最有研究和应用价值的方法，也是目前临床上应用最为广泛的方法。由于PCR方法、可用的核酸探针的种类、探针的标记及其检测方法多种多样，因此PCR与基因探针结合产生的新技术也是多种多样，较为重要的有：荧光定量PCR技术、基因探针扩增直接实验、PCR-ELISA技术和PCR-分子信标技术等。

(4) DNA指纹图谱技术。其基本原理是用限制性内切酶消化结核分枝杆菌染色体DNA上的特定的核苷酸序列，在琼脂糖凝胶电泳中分离后，将限制性片段转移至膜上，与带标记的DNA探针杂交，检测出与探针同源的限制性片段。这些片段数目和大小的变化使每株分离株呈现特征带型即指纹图谱型。目前用于菌株分型的遗传标记普遍采用插入序列或其他重复序列作为分型的标记。IS6110 DNA指纹图谱在结核病上可有效的鉴定菌株，已解决多种流行病学问题，已证明是一种有力的流行病学研究手段，但目前这种技术在临床上应用还很有限，只是选择性的对临床分离株进行基因分型，大规模的应用还有赖于DNA指纹图谱标准方法的推广、谱型计算机软件的开发和实验室技术人员素质的提高和实验条件的改善。

分子生物学方法以其敏感性好、特异性高和检测快速等特点，在结核病的诊断中发挥着巨大优势，并取得了较好的效果。但由于分子技术的高灵敏性和低特异性，或其他的一些或多或少的不足，导致这些方法都待进一步的成熟和完善。且多数分子生物学检测有赖于先进的检测仪器和独立的实验室，很难在基层实验室普及。因此，分子生物学技术到现在还无法取代结核病的传统检测方法。

二、结语

牛结核病是一种慢性消耗性疾病，一般区域性流行，具有感染率高而发病率低等特点。

传统的病原学检测方法虽然简便、经济、易行，但灵敏度低，特异性差，需要标本中有一定数量的细菌方能检出抗酸菌。但细菌的分离和培养，需花费大约3～8周的时间，若再进行菌株的分型鉴定和药敏实验又需要1～3个月的时间，这对于结核病的早期诊断与治疗无益。

目前临床上应用最广泛的是迟发性变态反应(DTH)试验，即结核菌素试验。该方法在牛结核病的诊断和防制过程中起到了重要的作用,美国和欧共体的许多国家利用该方法消灭和控制了牛结核病,以至于现在世界动物卫生组织仍以该方法作为牛结核病法定的检疫方法。研究发现，在相当数量的结核菌素试验阳性牛中，既找不出特征病变，又不能分离出结核菌，或仅仅分离出非典型的分枝杆菌，给基层的扑杀工作带来困难，因此在实际工作中用于诊断牛结核病并不十分理想。目前一些国家采用比较结核菌素试验(即比较皮内试验，SlCTT)。该方法在颈部一侧的不同部位，同时注射M.bovis PPD和M.avium PPD。对两种PPD的不同反应，能够提示被检动物是M.bovis感染还是非特异的DTH反应。杨经纬用传统的牛型PPD试验发现，在检出的98头阳性牛中，用比较变态反应试验发现7头为阴性，证实我国禽结核杆菌等非典型分枝杆菌确实影响了牛结核的检疫。使用比较变态反应，可以有效降低变态反应的非特异性反应。该方法适合在我国普遍推广。

γ-干扰素试验已在许多国家(澳大利亚、爱尔兰、新西兰、阿根廷、美国等)完成了田间试验，证明该方法的敏感性为77%～93.6%，高于结核菌素试验的敏感性(65.6%～84.4%)。IFN-γ 测 定 法不仅消除了结核菌素试验结果解释的主观性，而且缩短了试验的时间。但是γ-干扰素试验最大的缺点是价格昂贵，但目前国内已经研制出了国产的γ-干扰素试验试剂盒，随着临床试验数据的完善，γ-干扰素试验存在的问题也会迎刃而解。

因此，在牛结核病的监测和检疫中，笔者认为应用比较皮内试验或者γ-干扰素试验能很快的提高牛结核病的检出率，对于目前牛结核病的防控具有重要的现实意义。

（略）