卵巢癌细胞卡铂耐药相关肿瘤抑制基因的表达变化及其启动子区甲基化观察

唐兆前,李 力,张 玮,王 琪,唐步坚

(广西医科大学附属肿瘤医院,南宁 530021)

卵巢癌化疗药物耐药现象成为影响其疗效的主要原因。研究发现,在恶性肿瘤中表观遗传基因对于调控原发性以及获得性耐药都起重要作用[1],其中 DNA甲基化是基因突变及缺失之外肿瘤抑制基因失活的第三种机制。2008年 7月 ～2010年 2月,我们观察了卵巢癌卡铂耐药细胞系(SKOV3-CB)中各抑癌基因启动子区的甲基化状态,以探讨其与卵巢癌卡铂耐药的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 RNA抽提试剂 Trizol,逆转录试剂盒RevertAid Fiststrand cDNA Synthesis Kit,DNAzol基因组 DNA快速提取试剂盒,Cp Genome DNA修饰试剂盒,凝胶成像系统 quality-one,实时荧光定量 PCR仪,卵巢癌卡铂耐药细胞系 SKOV3-CB、亲本细胞系SKOV3及其表达谱芯片。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因的筛选

应用分子生物信息学方法,在“www.ncbi.nlm.nih.gov”网站,查找 “tumor suppressor gene”,筛选卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因,共 13个肿瘤抑制基因(VHL、COPS2、NOL7、GGNBP2、RBL1、S100A2、PARG1、PERP、TCF3、DNAJA3、ING1、RARRES3、RBBP8)表达下调。

1.2.2 SKOV3-CB、SKOV3耐药相关肿瘤抑制基因表达的检测 待 SKOV3-CB、SKOV3细胞长满瓶底的70%～80%时,获取细胞 1×107～5×107个,移入1.5 ml离心管中。根据 Trizol法提取细胞总 RNA并行凝胶电泳,用紫外分光光度仪检测抽提总 RNA的质量和浓度。要求 A260/A280为 1.8～2.0,并计算RNA含量。cDNA合成参照逆转录试剂盒说明书操作。RT-PCR反应:应用引物设计软件 Primer 5.0设计引物,并由上海生工生物技术有限公司合成。在DNA Engine Opticon TM连续荧光检测系统中进行扩增。阴性对照以无 RNA酶的水代替 cDNA模板。每例样品及对照均设 3个平行复孔,取平均值。反应结束后,由软件自动得出荧光反应曲线以及每个标本反应体系的扩增效率及 CT值。SKOV3-CB相对于 SKOV3表达的计算公式:XN,q/XN,cb=

1.2.3 SKOV3-CB、SKOV3耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态检测 登陆“http://genome.ucsc.edu/”查找出各基因的启动子,应用 Methyl Primer Express Software Version 1.0软件,对所筛选基因进行 CpG岛评估,设计出 8个基因(VHL,COPS2、NOL7、RBL1、PARG1、PERP、DNAJA3)的引物,由上海生工生物技术有限公司合成。采用甲基化特异性 PCR(MS-PCR)法检测 SKOV3-CB、SKOV3细胞 8个基因启动子区甲基化状态,操作按试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 SKOV3-CB、SKOV3耐药相关肿瘤抑制基因表达情况 与 SKOV3耐药相关肿瘤抑制基因表达比较,除 GGNBP2基因外,其余 12个基因 VHL、COPS2、NOL7、RBL1、S100A2、PARG1、PERP、TCF3、DNAJA3、ING1、RARRES3、RBBP8 均在 SKOV3-CB中表达下调,下调倍数分别为 65.24、1.30、2.94、5.95、27.13、1.57、1.32、12.93、46.8、7.57、14.00、23.98。

2.2 SKOV3-CB、SKOV3耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态 MS-PCR结果显示,ING1、NAJA3、VHL甲基化引物均能够扩增出产物,未甲基化引物均不能扩增出产物；COPS2、PERP甲基化引物均不能够扩增出产物,未甲基化引物均能够扩增出产物；PARG1,、NOL7、RBL1甲基化引物与未甲基化引物均能够扩增出产物。

3 讨论

基因甲基化是一种可遗传的、酶诱导的、对基因结构的特殊碱基序列起稳定作用、负责编码正常基因的化学修饰。即在甲基转移酶(DNMTS)作用下将一个甲基集团加到 DNA分子核苷酸碱基上的生化过程[3]。人类 DNA甲基化 90%发在 CpG二核苷酸,基因组中 Cp G密集的区域称作 CpG岛,多分布于 5′和 3′非编码区。尽管全基因组中 CpG岛甲基化是高发的,但在活化基因的 5′非编码区启动子区内,CpG岛都呈去甲基化状态[4]。如果启动子区CpG岛发生甲基化,将直接或间抑制转录,导致下游基因表达沉默。因此,启动子区 CpG岛甲基化是抑制基因表达的重要机制。

肿瘤抑制基因启动子区 CpG岛频繁发生异常的甲基化,导致基因沉默或表达下调[5]可能是卵巢癌患者化疗耐药的重要原因[6]。其甲基化状态可作为反映药物疗效和抗药性的一个有用的指标[7]。因而,探讨其可能的甲基化机制,对卵巢癌卡铂耐药的研究有重要意义。即便没有甲基化机制参与,也可为进一步探讨其他的可能机制提供参考。我们通过卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因的检测,发现13个基因中 ,VHL、COPS2、NOL7、RBL1、S100A2、PARG1、PERP、TCF3、DNAJA3、 ING1、 RARRES3、RBBP8共 12个基因表达下调。这表明多肿瘤抑制基因参与卵巢癌卡铂耐药。通过对下调基因启动子区 CpG岛评估,发现有 8个基因 (ING1、PERP、RBL1、COPS2、VHL、PARG1、 NOL7、DANJA3)能够设计出甲基化引物进行 MSP。MSP结果显示,在卵巢癌卡铂耐药细胞系与其亲本细胞系中,ING1、DNAJA3、VHL甲基化引物均能够扩增出产物,未甲基化引物均不能扩增出产物；COPS2、PERP甲基化引物均不能够扩增出产物,未甲基化引物均能够扩增出产物；在两种细胞系中 PARG1、NOL7、RBL1甲基化引物与未甲基化引物均能够扩增出产物。换言之,本研究没有发现以上两种细胞系各相关肿瘤抑制基因启动子区有差异甲基化。因此,卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区无超甲基化,甲基化机制不是引起卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达下调的原因。

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