TUBB3-ASODN对食管鳞癌细胞 Ec9706/P-1耐药性的影响及机制探讨

卢 红,樊青霞,王瑞林

(1河南大学淮河医院,河南开封 475001；2郑州大学第一附属医院)

临床发现,肿瘤细胞的耐药性严重影响了食管鳞癌患者的化疗效果。在前期实验中,我们成功诱导了人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株 Ec9706/P-1[1]。2006年 12月 ～2007年 6月,我们观察了 β-微管蛋白Ⅲ(TUBB3)反义寡核苷酸(ASODN)对 Ec9706/P-1耐药性的影响,并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Ec9706/P-1,Lipofectamin2000,RT-PCR一步法试剂盒,鼠抗人 β-TubulinⅢ单克隆抗体,SP-9000免疫组化试剂盒,紫杉醇,TUBB3-ASODN及其无义寡核苷酸(NSODN)均由北京赛百盛公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组 取对数生长的 EC9706/P-1细胞,制备单细胞悬液,计数种板后分为 A、B、C三组。A组不处理,B、C组分别加入 NSODN、TUBB3-ASODN转染 24 h,参考 Lipofectamin2000说明书操作。每组设 4个复孔。

1.2.2 细胞耐药情况观察 采用 MTT法。各组加入 100、10、1、0.1、0.001 μg/ml的紫杉醇培养 24 h,再加入 MTT溶液培养 4 h,弃上清。加入 DOSM,振荡10 min,用酶标仪检测 490 nm波长处各孔的吸光度(A值),重复 3次。细胞抑制率 =(1-实验组 A值 /亲本细胞A值)×100%。以药物浓度为横坐标,细胞抑制率为纵坐标,按作图法计算细胞半数抑制浓度(IC50)。耐药指数(RI)=耐药细胞 IC50/亲本细胞系EC9706细胞 IC50。

1.2.3 细胞周期检测方法 用 0.25%胰蛋白酶消化细胞,计数 1×106个细胞,PBS冲洗 2遍,以 70%乙醇固定,进行 PI染色,过滤标记荧光,于流式细胞仪上检测细胞周期。

1.2.4 TUBB3蛋白检测方法 采用免疫细胞化学法,按试剂盒说明书操作。光镜下每高倍视野(×400)随机观察 100个细胞,以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性细胞,计算阳性细胞所占百分比。

1.2.5 TUBB3 mRNA检测方法 收集各组细胞,分别抽提总 RNA,参照一步法 RT-PCR试剂盒说明书进行 RT-PCR扩增。应用凝胶成像分析系统测定各组光密度(OD)值,以 TUBB3与 β-actin的 OD比值表示 TUBB3 mRNA相对表达量。

1.2.6 统计学方法 采用 SPSS11.0统计软件。数据比较采用成组 t检验。P≤0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞耐药情况比较 C组紫彬醇 IC50为(7.78±1.15)μg/ml、RI为 3.37,B组分别为(16.56±1.80)μg/ml、7.17,A组分别为(15.40±2.06)μg/ml、6.67,C组与 A、B组比较,P均 ＜0.05。

2.2 各组细胞周期检测结果比较 C组 G0+G1期细胞百分比为 78.7% ±2.3%,S期为 14.3% ±2.1%,G2+M期为 7.0% ±0.9%；B组分别为87.3%±1.2%、6.9%±0.4%、5.8%±0.8%,A组分别为85.9% ±1.1%、7.5% ±0.5%、6.7% ±0.9%,C组 G0+G1期、S期细胞百分比与 A、B组比较,P均 ＜0.05。

2.3 各组 TUBB3蛋白及其 mRNA表达比较 C组 TUBB3蛋白阳性率为 33.68%±8.34%、TUBB3 mRNA相对表达量为 1.33±0.08,B组分别为62.96%±10.49%、1.59±0.06,A组分别为64.47%±11.75%、1.60±0.10,C组与 A、B组比较相比,P均 ＜0.05。

3 讨论

紫杉醇是从红豆杉树皮中提取的一种抗微管药物,广泛用于肿瘤的治疗。微管是真核细胞的一种纤维蛋白,与细胞的有丝分裂密切相关。紫杉醇在与微管蛋白质结合,形成稳定的微管束,并使之不被解聚,促进其聚合,从而使肿瘤细胞停止在 G2期和M期,抑制细胞复制,阻止癌细胞增殖。但随着药物的使用,逐渐发现肿瘤细胞对其耐药性增加。

紫杉醇耐药与细胞内微管蛋白及其同型的变化有关[2],这些变化包括微管蛋白解聚、点突变、β-微管蛋白亚型表达改变、α-微管蛋白乙酰化,其中关于TUBB3的研究较多。Kamath等[3]研究发现,在紫杉醇存在时,TUBB3高表达细胞株的微管活动被抑制的程度低于 β-微管蛋白Ⅰ高表达细胞株；而无紫杉醇时二者无差别,认为 TUBB3通过降低紫杉醇抑制微管活动的能力导致细胞耐药。Urano等[4]发现,20例接受多烯紫杉醇治疗的进展期胃癌患者,TUBB3低水平者疗效较好。Mozzetti等[5]发现,紫杉醇化疗无效卵巢癌患者都存在 TUBB3在基因和蛋白水平高表达。

本研究将 TUBB3-ASODN体体外转染 Ec9706/P-1后,TUBB3 mRNA及其蛋白水平明显降低,并使Ec9706/P-1细胞对紫杉醇的敏感性增加,RI明显降低。其原因可能是转染 TUBB3后,微管蛋白稳定性增加,微管平衡恢复,从而使细胞有丝分裂正常进行,促进细胞周期的循环,使 G1期细胞比例略有下降,S期细胞比例略有增加。C组提示 TUBB3在紫杉醇耐药过程中可能起关键作用,即反向证明了TUBB3高表达是导致细胞对紫杉醇耐药的因素之一,但具体机制有待进一步研究。

[1]卢红,樊青霞,王瑞林,等.耐紫杉醇食管鳞癌 Ec9706/P-1的建立及特征[J].中国肿瘤临床,2007,34(13):731-734.

[2]Rosell R,Taron M,Sarries C,et al.β-Tubulin mutational analysis:tantalizing findings[J].Lung Cancer,2002,35(1):11-17.

[3]Kamath K,Wilson L,Cabral F,et al.BetaIIItubulin inducespaclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability[J].J Biol Chem,2005,280(13):12902-12907.

[4]Urano N,Fujiwara Y,Doki Y,et al.Clinical significance of class III beta-tubulin expression and its predictive value for resistance to docetaxel-based chemotherapy in gastric cancer[J].Int J Oncol,2006,28(2):375-381.

[5]Mozzetti S,Ferlini C,Concolino P,et al.Class III beta-tubulin overexpression is a prominent mechanism of paclitaxel resistance in ovarian cancer patients[J].Clin Cancer Res,2005,11(1):298-305.