果蔬中农药残留速测技术的应用与发展

王洁莲，张子伦

（山西省农产品质量安全检验监测中心，山西太原030001）

在我国，果蔬中农药残留试验开始于20世纪60年代，最早采用的是容量法和比色分析法。随着科学技术的进步及仪器设备的改进，20世纪80年代普遍采用气相色谱、高效液相色谱、气—质联用色谱等先进仪器进行分析。目前，国内外农药残留快速检测技术主要包括生物检测、生化检测和化学检测三大类，其中，生物检测主要指采用生物活体分析的方法，生化检测主要包括酶抑制法、免疫分析法、生物传感器等方法，化学检测主要是仪器分析法。目前果蔬中农药残留检测方法应用最广泛的是仪器分析法和以酶抑制法为基础研制的各种快速检测工具。仪器分析法的定性定量检测，灵敏度高、结果相对正确，但投资大、检测时间长、对人员技术要求高，不利于现场监测。而利用酶抑制法这一原理生产的各种快速检测仪正在越来越多地进入各地蔬菜基地、批发市场等，已成为我国农药残留快速检测的主流技术。

1 生物检测技术

1.1 发光菌检测法

农药与细菌作用后可影响细菌的发光程度，不同种类的发光细菌的发光机制相同[1]，即由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素核甘酸（FMNH2）及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长450～490 nm的蓝绿光。常用的发光菌有弧菌属和发光杆菌属的一些细菌，但是发光菌被激活后，它的发光强度会随时间的变化而改变。因此，实际分析时，必须选择发光变化率较小的时间来测试。发光菌检测法只对少数药剂有反应，无法辨别残留农药的种类，准确性较低。所以，该法在食品安全检测中的应用还不多见。

1.2 敏感家蝇检测法

农药残留会导致家蝇中毒[2]。使用敏感品系的家蝇为材料，用样本喂食敏感家蝇后，根据家蝇死亡率便可测出农药残留量。使用家蝇检测蔬菜中的农药残留，过程简单，农户可自行检测。而此项技术的最早应用在台湾，其局限性为需要繁殖大量的敏感性家蝇，前期准备工作比较复杂。该法只对少数药剂有反应，无法分辨残留农药的种类，准确性较低，且仅适于田间未采收的蔬菜。另一方面，由于近年来农药种类急增，而家蝇等检测生物对毒性较低的合成拟除虫菊酯类农药十分敏感，使对残留农药的判断产生一定的困难，影响生物检测法的实际效果和应用。

2 生化检测技术

2.1 酶抑制法

酶抑制法是我国农药残留快速检测技术中应用最多也相对成熟的一种残留快速检测技术，特别是以酶抑制法为基础研制的各种速测工具，成为仪器分析法的有效补充。目前，酶抑制法应用较为广泛的是胆碱酯酶抑制法，用于测定有机磷和氨基甲酸酯类农药残留。将该酶与样品提取液反应[3]，如果存在上述2类农药，酶活性会受到抑制，显色后吸光度与没有这2类农药存在时不同。基于这一原理，已开发出速测箱、速测卡、快速测定仪等多种类型的产品。

2.1.1 速测箱法 速测箱法是基于胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸和靛酚（蓝色）[4]，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变。将胆碱酯酶与样品提取液反应，若胆碱酯酶未受到抑制，基质水解产生蓝色，表明样品提取液中不含有机磷和氨基甲酸酯类农药（呈阴性）；若胆碱酯酶受到抑制，基质就不能水解，不变色，表明样品中含有有机磷和氨基甲酸酯类农药（呈阳性）。该方法对常见农药的检出限量大都高于相应农药的最大残留限量，因此，其只能作为定性的快速初筛检测法。

2.1.2 速测卡法 农药速测卡中一般含有白色和红色2种药片[5]。白色药片中含有胆碱酯酶，它是一种由蛋白质分子构成的生物催化剂，主要分布于动物体神经传导组织，专门催化神经传导介质乙酰胆碱的水解反应。红色药片中含有乙酰胆碱类似物靛酚乙酸酯，靛酚乙酸酯在胆碱酯酶的催化下可迅速发生水解反应，生成靛酚（蓝色）和乙酸。只要有微量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，就能强烈地抑制蓝色产物的产生，靠目测就可从蓝色的深浅来判断农药的残留。对呈阳性结果的样品，可用其他分析方法进一步确定具体农药的品种和含量。

2.1.3 速测仪[6]趋于市场的需求，近年来各种快速检测仪已成为我国农药残留快速检测的主流技术。其原理是：残留农药对乙酰胆碱酯酶活性有抑制作用，浓度越高，抑制率越高，通过仪器测定酶与底物、显色剂显色反应的变色速率，并与空白对照比较求得酶抑制率，从而判定农药残留量是否超标。

2.1.4 传感器法 它是将传感技术与农药免疫分析技术相结合而建立起来的方法，是免疫分析技术的一种延伸或分支。在农药残留速测分析上应用的有生物传感器法和同相传感器法。

2.1.4.1 生物传感器法[7]生物传感器是由一种生物敏感部件与转换器紧密配合，对特定化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置，通过测定pH和电导等物理化学信号的变化，即可测得农药残留量。其存在的主要问题是分析结果稳定性差，重现性不好，使用寿命短。但此方法在我国还主要停留在研究开发阶段。

2.1.4.2 同相传感器法[8]通常用压电结晶，即当附加电压时，晶体震动的能力取决于晶体的质量和大小，而晶体上包被了能吸附目标物的材料，当晶体配基接触时就会发生吸附，随之晶体的质量和频率发生变化。频率的改变与吸附在晶体上的物质的含量有关，以此进行定量测定。

2.2 免疫分析法（IA）

免疫分析法又叫酶免疫吸附分析法，是基于抗原抗体特异性识别和结合反应为基础的分析方法，包括放射性免疫分析法、酶联免疫分析法、荧光免疫法、免疫胶体金法、多组分分析物免疫分析法、流动注射免疫分析法、免疫传感器分析法等，最为常用的是酶联免疫分析法。

2 2.1 放射性免疫分析法（RIA） 它是起步比较早的一种免疫分析法，是将抗血清与待测农药在试管中培育一定的时间后，加入同位素标记的待测农药，该同位素标记农药和待测农药竞争，并

与抗体发生结合反应，再采用适当的方法将被抗体结合的和未被抗体结合的标记农药分离，则未被抗体结合的放射性标记农药留在了溶液中。待测农药含量越大，则标记农药被抗体结合的量就越少，游离的标记农药就越多，溶液中的放射强度就越大。因此，待测农药的含量与反应后溶液中的放射强度成正比，根据放射强度即可得待测物含量。

2.2.2 酶联免疫分析法（EIA） 它是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的农药残留检测方法，具有专一性强、灵敏度高、快速、操作简单等优点。试剂盒可用于大量样品的现场快速检测，定性、定量准确，但该法对试剂的选择性很高，很难同时分离多种成分，并对结构类似的化合物也有一定的交叉反应。

2.2.3 流动注射免疫分析法（FIIA[9]）它是最新的农药残留检测技术，适用于连续测定和大流量样品的测定，更易于实现自动化，能更快速、灵敏地测出结果。FIIA所需时间由EIA的1.5 h缩短至6.5 min。FIIA的不足之处是：变异系数大，需要1次性装膜的柱子抗体，且酶标的半抗原使用量大，1次只能检测1个样品。最近，但德忠等综合了荧光免疫分析、光纤传感器、流动注射、免疫磁珠分离4项先进技术，建立起一种新型荧光光纤免疫磁珠流动分析系统。该系统既可进行普通的荧光分析、动力学荧光流动分析，又可进行荧光光纤免疫流动分析。该分析法比EIA更灵敏，标记物也不易失活，与RIA相比无放射性污染。免疫磁珠集吸附、富集、分离等功能于一体，结合流动分析停留技术和可控电磁场，可在分离过程中完成抗体（抗原）结合态和游离态标记物的自动在线分离，避免一般流动免疫分析中柱的再生和膜的更换。

2.2.4 荧光免疫分析法（FIA） 它是将抗血清、待测农药、荧光标记的待测农药混合在聚苯乙烯管中，经培育后加入卜球蛋白和分子量为6 000的聚乙二醇，使与之结合的待测农药和荧光标记的待测农药沉淀下来；未被结合的荧光标记的待测农药留在上清液中。当抗血清与荧光标记待测农药的量一定时，含待测农药多的试管中，抗体结合的荧光标记的待测农药较少，上清液中游离的荧光标记的待测农药就多，即待测物含量与游离的荧光标记物含量成正比，测定上清液的荧光强度，即可算出待测物含量。Eremin报道了一种快速的荧光偏振光免疫分析（PFIA）。PFIA是一种基于荧光标记的半抗原与特异性抗体结合后半抗原的荧光极性增强的检测手段。若样品中含有未标记的被测物，它就会与抗原竞争与抗体结合，从而使极性信号降低。这种PFIA技术不需要对样品进行任何浓缩或冲洗，可直接分析。

2.2.5 多组分分析物免疫分析法（MIA）[10]它是指在同一份样品中，同时测定2种或2种以上的相关分析物的免疫分析技术。MIA的原理是在被测物中加入由不同标记物标记的抗原或半抗原的混合物，用竞争法测定各自对应抗原的含量。目前常用的标记物有放射性物质、酶和荧光素等物质。

2.2.6 免疫分析技术及其他分析技术的联用单独使用IA获得的信息量少，而理化分析方法的选择性差。将免疫分析法和理化分析法联合起来使用，可使整个分析方法简化，进一步提高检测效率。液相色谱法（LC）与免疫分析法（IA）的联用，将LC的高分离能力和IA的高灵敏性、高特异性融为一体。LC-IA分析法尤其适合多组分残留分析和微量分析。免疫分析与气相色谱—质谱（GC-MS）的联用可减少结构相似的农药或代谢产物分析中的交叉反应，降低假阳性。

3 化学检测技术

化学检测主要是运用仪器分析的方法。仪器分析法结果准确可靠，是农药残留检测中最经典、最常用的分析方法，但因其技术含量高、操作程序相对复杂，且需要特定的实验条件和具有一定专业技术的人员进行操作，一般不适用现场检测，以下为几种常见的仪器分析方法。

3.1 与色谱分析相关的检测方法

3.1.1 气相色谱法（GC） 它是一种经典的分析方法。近年来，毛细管柱气相色谱广泛应用于挥发性农药残留测定。其检测器有电子捕获检测器（ECD）、火焰光度检测器（FPD）、氮磷检测器（NPD）、原子发射检测器（AED）、质谱检测器（MSD）等。NPD是测定有机磷和氨基甲酸酯等农药的常用检测器；AED不仅可检测目标化合物表中所列的农药，而且还可检测几百种农药及代谢物。气相色谱法适用于多种样品一次进样，得到完全分离以及定性和定量测定。

3.1.2 高效液相色谱法（HPLC） 它是以液体作为流动相的色谱分析法，主要用于高沸点、热稳定性差、相对分子质量大的农药的分离和分析。由于只能检测对紫外线有吸收和本身能发射荧光的农药，因而限制了其应用范围。

3.1.3 薄层色谱法（TLC） 它是利用被检测物经显色后同标准物质比较来定性、用薄层扫捕仪来定量的测定方法。薄层色谱法显色反应类型多，显色剂范围广，快速，不受物质限定，因此，它特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的农药残留。

3.1.4 超临界流体色谱法（SFC） 它是以超临界流体作为流动相的色谱分析技术，可在较低温度下分析分子量较大的化合物。对热不稳定的化合物和极性较强的化合物，其可与各种气相、液相色谱检测器匹配，还可与红外、质谱联用。

3.1.5 色谱—质谱联用法（GC-MS） 凡能用气相色谱法进行分析的样品，大部分都能用该法进行定性及定量测定。但随着农药残留限量要求的进一步提高以及样品基质的影响，该技术的应用也受到了一定的限制。

3.1.5.1 气相色谱—串联质谱仪联用法（GC-MS） 它是以离子阱为质量分析器的离子阱串联质谱仪，灵敏度高。目前，该技术不仅适用于复杂基体混合物的定性分析，而且可以利用得到的二级质谱结果进行定量，但是其仅能检测目标分析物，很难一次进样分析大量化合物。

3.1.5.2 液相色谱—质谱联用法（LC-MS） 可用于易挥发、热不稳定、分子量较大、难以用气相色谱分析的化合物的检测。它具有检测灵敏度高、选择性好、定性定量同时进行、结果可靠等优点。该方法具备多残留分析的能力，用于初级监测呈阳性反应的样品的确证（初级监测呈阳性反应的样品检测不出农药种类，而用上述方法可确定农药的种类），优势明显。

3.2 直接光谱分析法

近红外衰减伞反射光谱技术和表面增强拉曼光谱技术使光谱分析的灵敏度提高102～107倍。直接光谱技术所需样品量极少，具有很大的应用潜力。目前，衰减全反射—傅里叶变换红外光谱联用法监测农残的灵敏度高于透射光谱法，具有快速、简便、检样量少、无需预处理等优点。

3.3 毛细管电泳（CE）

CE的作用原理是使用毛细管柱内的不同带电粒子在高压场作用下以不同的速度在背景缓冲液中定向迁移，从而进行分离。它具有灵敏度高、耗资少、样品消耗量小、使用方便等优点，但其进样量少，检测光程短，浓度检测限较高。

4 实验室自动化分析法

使用实验室机器人进行农药残留分析也进入研究阶段，研制方便、灵活、运行速度快、体积小的实验室机器人，制定标准化的实验方法，将是未来的现代化实验室的发展方向。

5 结语

仪器分析法的定性定量检测，灵敏度高、结果相对正确，但投资大、检测时间长、对人员技术要求高，不利于现场监测，而在残留分析技术中其地位仍是不可取代的。利用酶抑制法这一原理生产的各种快速检测仪、速测卡等正在越来越多地进入各地蔬菜基地、批发市场等，已成为我国农药残留快速检测的主流技术，特别是快速检测仪的运用已日趋广泛。同时，新的检测方法不断涌现，特别是多残留的同时测定及单个农药在多种样本中的测定都取得了重要进展，且检测方法也向简便、快捷、灵敏度高的方向发展。

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