新辅助化疗后乳腺癌组织中survivin表达及其与Ki-67、AI的相关性研究

孙迪文

新辅助化疗后乳腺癌组织中survivin表达情况与肿瘤细胞凋亡、增殖的关系及其对乳腺癌化疗敏感性和疗效预测的临床意义，目前报道较少[1]。

本研究应用免疫组化SABC法，检测60例术前行新辅助化疗及60例术前未行新辅助化疗的乳腺癌组织中survivin和Ki-67的表达情况，同时采用TUNEL法检测凋亡细胞，从不同层面对新辅助化疗后乳腺癌组织的变化进行全面观察，旨在探讨其相关性和临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取我院2003年3月～2005年6月收治临床资料完整术前行新辅助化疗的60例乳腺癌石蜡包埋标本作为研究对象，以同期60例术前未行新辅助化疗的病例作为对照组。全部病例均为浸润性乳腺癌，其中包括浸润性特殊癌4例(乳头状癌2例、髓样癌1例、黏液腺癌1例)和浸润性非特殊癌56例(浸润性导管癌45例、浸润性小叶癌7例、髓样癌1例、硬癌2例、单纯癌1例)；均行改良根治术。60例新辅助化疗组患者化疗前均经粗针穿刺细胞学检查证实为乳腺癌，均为女性，年龄34～69岁，平均年龄46.2岁，中位年龄45岁。TNM分期：Ⅱb期21例；Ⅲa期25例；Ⅲb期14例。对照组60例患者，均女性，年龄32～70岁，平均年龄47.3岁，中位年龄46岁。TNM分期：Ⅱb期23例；Ⅲa期24例；Ⅲb期13例。

1.2 检测方法

1.2.1 免疫组织化学 标本均经4%甲醛固定，常规组织脱水，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，分别行HE和免疫组织化学染色。采用SABC免疫组织化学方法(链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物 SABC)检测survivin和Ki-67的表达。严格按照试剂盒说明要求进行操作，一抗稀释度1∶100，微波修复抗原，DAB显色，苏木精复染。用已知阳性切片作为阳性对照(survivin阳性对照片为结肠癌，Ki-67阳性对照片为皮肤切片)，PBS代替一抗作为阴性对照。兔抗人PTEN多克隆抗体(即用型 1∶100)和兔抗人VEGF抗体(即用型 1∶100)均购自Santa Gruz公司，即用型SABC试剂合和DAB染色试剂购自武汉博士德试剂公司。

1.2.2 细胞凋亡 采用原位细胞末端转移标记法(TUNEL法)测定细胞凋亡，严格按照试剂盒说明要求进行操作，用DAB显色，用已送的阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判断

1.3.1 化疗后癌组织病理形态学改变及化疗疗效判定标准 化疗疗效评定标准分为三级[2]：Ⅰ级为完全缓解(相当于临床的cCR)，即肿瘤原发灶消失，完全被纤维组织取代(Ⅰa级)或肉眼无肿块，仅在显微镜下看到少量残存的癌细胞(Ⅰb级)；Ⅱ级为部分缓解(相当于临床的cPR，见图1)，既原发灶>60%肿瘤细胞出现变形或坏死(Ⅱa级)或原发灶20%～60%肿瘤细胞出现变形或坏死(Ⅱb级)；Ⅲ级为无效(相当于临床的NC)，既原发灶<20%肿瘤细胞有轻度的变形、坏死或者没有明显的变化。CR+PR为总有效率。

1.3.2 免疫组化结果判断标准 survivin免疫组化阳性产物呈棕黄色细颗粒状，主要定位于细胞胞质内，部分胞膜表达。Ki-67免疫组化阳性产物呈棕黄色颗粒状，定位于细胞核内。采用半定量积分法[2]，将染色强度分为3级：无着色记1分，浅着色记2分，棕黄色记3分；按阳性肿瘤细胞的百分比分3级：≤25%为一级记1分，26%～75%为二级记2分，≥76%为三级记3分。每张切片最后的得分为两次评分的乘积(1～9)，≥3分为阳性，≤3分为阴性。

1.3.3 细胞凋亡指数(AI)的测定 采用TUNEL法，检测细胞凋亡指数细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。每张切片在400倍镜下随机选择10个视野，每个视野记数100个肿瘤细胞，共记数1000个肿瘤细胞。凋亡细胞所占肿瘤细胞总数的百分率即凋亡指数[AI=凋亡细胞数/肿瘤细胞总数(1000)×100%]。

1.4 化疗方法

新辅助化疗组60例患者，术前均应用CTF方案化疗2个周期，化疗结束后两周行改良根治术。CTF方案：吡柔吡星(THP)500 mg/m2，第1天静脉推注；环磷酰胺(CTX)600 mg/m2，第1、8天静脉推注；5-氟脲嘧啶(5-Fu)500 mg/m2，第1、8天静脉滴注；28天为1个周期。对照组60例患者，术前未行化疗。

1.5 统计学处理

应用SPSS 10.0统计软件对数据进行统计分析，P<0.05认为差别有统计学意义。组间比较，采用χ2检验和t检验，survivin和Ki-67及 AI之间的关系用线性相关分析。

2 结 果

2.1 乳腺癌组织中survivin和Ki-67的表达情况

新辅助化疗组survivin阳性表达率为36.7%(22/60)，明显低于对照组(71.7%，43/60 )(χ2=14.821，P<0.01)。新辅助化疗组Ki-67阳性表达率为38.3% (23/60)，明显低于对照组(61.7%，37/60；χ2=6.533，P<0.05)。

2.2 乳腺癌组织中细胞凋亡情况

正常乳腺组织、肿瘤组织及间质内均出现TUNEL检测阳性的凋亡细胞，但在肿瘤坏死周围的凋亡细胞明显增多。新辅助化疗组AI平均为(9.34±3.12)%；对照组AI平均为(5.27±3.16)%，t=1.998，P<0.05。

2.3 新辅助化疗后病理形态学改变及其与survivin表达的相关性

60例新辅助化疗患者中完全缓解(pCR)为0例，44例部分缓解(pPR)，16例无变化(NC)，新辅助化疗总有效率为73.3%(44/60)。新辅助化疗后病理形态学改变Ⅱ级病例的survivin阳性表达率(18.2%，8/44)，明显低于Ⅲ级病例(81.3%，13/16)(χ2=20.514，P<0.001)。

2.4 survivin表达与Ki-67表达及AI的关系

survivin和AI之间的相关系数γ=-0.36(P<0.05)，survivin表达与Ki-67表达的相关系数γ=+0.47(P<0.05)。说明survivin表达与癌细胞的AI呈负相关，而与Ki-67表达呈正相关。

3 讨论

研究表明，乳腺癌具有易发生血道转移的生物学特征，在全部初诊乳腺癌患者中，有半数以上已发生血道转移[3，4]。因此，新辅助化疗已成为乳腺癌综合治疗的重要组成部分。

为了提高新辅助化疗后肿瘤的缓解效果，目前，新辅助化疗多采用联合化疗方案。大量临床研究显示，CTF方案是目前经典的乳腺癌化疗方案之一，治疗乳腺癌缓解率高，而脱发和心脏毒性明显降低，更适合长期、系统的化疗。本研究采用该方案对60例乳腺癌患者进行新辅助化疗，均能良好耐受，未发生严重并发症，总有效率达73.3%，进一步说明CTF方案新辅助化疗疗效好。

survivin是凋亡抑制蛋白(IPA)家族的新成员，具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双功能蛋白，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。Survivin在多种肿瘤等增殖细胞中有不同程度表达[3～5]。Satoh研究发现[4]，胰腺癌survivin阳性表达率76.9%，survivin表达上调与AI有关。本研究发现survivin表达水平新辅助化疗组显著低于对照组，而在新辅助化疗组其表达水平与化疗后病理形态学改变分级密切相关，其在术前化疗后部分缓解(Ⅱ级)病例的表达水平显著低于无效者(Ⅲ级)，提示术前CTF方案化疗可部分抑制乳腺癌细胞survivin的表达，这可能是新辅助化疗抑制肿瘤的机制之一。

通过诱导肿瘤细胞凋亡是抑制肿瘤发展的重要手段，大多数的化疗药物都是通过诱导细胞凋亡消除肿瘤细胞[3～5]。Davis等[5]报道，对乳腺癌采用docetaxel联合doxorubicin新辅助化疗的病例，在化疗前和化疗后24、48 h分别取肿瘤组织测定肿瘤细胞凋亡水平变化显示，化疗后48 h测得的细胞凋亡水平值最高，化疗病理反应与细胞凋亡程度呈明显正相关。本研究显示，新辅助化疗组较对照组肿瘤细胞的AI明显提高(9.34% v 5.27%)，从而提示有效的新辅助化疗可促进乳腺癌的凋亡。

通过诱导降低肿瘤细胞的增殖能力是抑制肿瘤发展的另一重要手段。Ki-67抗原是目前公认的1种与细胞增殖密切相关的蛋白，其表达与细胞周期密切相关，它在G1后期开始出现，在S期和G2期逐渐升高，M期达到高峰，有丝分裂后逐渐降解消失，半衰期仅为1h甚至更短，且不表达于DNA修复状态的细胞，因此能准确地反映肿瘤细胞的增殖活性，并与多种肿瘤的发展、转移及预后有关[6]。Parton等[6]发现，化疗药物作用于乳腺癌细胞24 h以后，Ki-67水平显著降低。本研究显示新辅助化疗组患者肿瘤细胞的Ki-67阳性表达率明显低于对照组，从而提示新辅助化疗可使肿瘤细胞增殖能力降低，细胞活性下降。

我们分析了survivin表达与AI值的关系，发现survivin表达水平与癌细胞凋亡指数呈负相关，说明survivin的异常表达对细胞凋亡起一定抑制作用。Yu等[7]在对胃癌和Satoh等[4]对胰腺癌的研究中都证实了这一点。Tanaka等[1]采用免疫组织化学染色检测了167例乳腺癌组织中survivin表达，阳性率为70.7%，且survivin表达与AI有明显的相关性。

我们也分析了survivin表达与Ki-67的关系，发现两者呈正相关，说明survivin不仅参与了凋亡调控，还促进了细胞增殖。Survivin促进细胞增殖的机制可能为survivin蛋白通过竞争性地与周期蛋白(Cyclin)和周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)的复合物(主要为CyclinD-CDK4)结合，使得细胞蛋白依赖性蛋白激酶抑制蛋白(CKI 如P21蛋白)从上述复合物中释放出来，解除了DNA复制依赖因子—Ki-67的抑制，增强了CDK的活性，从而使G1→S期促进细胞增殖。

[1] 王卫东.凋亡抑制因子Survivin的研究进展〔J〕.国外医学-肿瘤学分册，2002，28(4):250.

[2] 刘 巍，张祥宏，张志刚，等.CAF方案新辅助化疗对乳腺癌组织BCSG1蛋白表达的影响〔J〕.中国肿瘤临床，2005，32(6):301.

[3] Depowsski PL，Rosenthal SI，Ross JS.Loss of expression of the PTEN gene protein product is associated with poor outcome in breast cancer〔J〕.Mod Pathol，2001，14(4):672.

[4] Satoh K，Kaneko K，Hirota M，et al.Expression of surviving correlated with cancer cell apoptosis and is involved in the development of human pancreatic duct celltumors〔J〕.Cancer，20001，92(2):271.

[5] Davis DW，Buchholz TAA，Hess KR，et al.Automated q-uantification of apoptisis after neo-adjuvant chemotherapy for breast cancer:early assessment predicts clinical response〔J〕.Clin Cancer Res，2003，9 (3):955.

[6] Parton RJ，Makris A，Davies C，et al.Vascular endothelial growth factor fails to predict response to neoadjuvant chemoheropy for primary breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2002，76 (suppyl 1):122.

[7] Yu J,Kuwabara Y,Mitanim ET AL.Expression of surviving in gastric cancer: correlation with the prognosis and response to chemotherapy〔J〕.Int J Cancer, 2001,95(2):92.