中草药拮抗内毒素作用机制研究进展

吕根法,王国治,石宏伟,王晓红,郑宏志,吴天顺

内毒素(Lipopolysaccharide, LPS)是G-菌细胞外膜的重要组成部分, 它是引起全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)或脓毒症(sepsis)等疾病的主要启动子[1]。内毒素性疾病的防治研究是近 30多年来国际医药学界研究最为活跃的领域之一。其防治性措施有内毒素中和蛋白、抗细胞因子及其受体的拮抗剂、应用血管活性药改善血液循环等[2], 广泛涉及抗菌、抗毒素、多器官保护等, 但至今仍无有效的药物供临床使用。中医药在治疗脓毒症方面具有悠久历史,研究表明中药可通过直接破坏内毒素、促进内毒素代谢、抑制巨噬细胞的活化等机制发挥对脓毒症的治疗作用[3], 如双黄连、板蓝根和清开灵、穿琥宁、鱼腥草、大青叶等中药在体外具有抑制内毒素介导的鲎试剂反应;青蒿素、大黄素、丹参素等中药有效成分亦具有拮抗内毒素的作用。更令人关注的是赤芍、连翘、黄芩等单味中药可破坏大肠杆菌内毒素的结构, 因此, 如果能够从中草药制备到与LPS作用的有效成分, 对开辟新的拮抗内毒素药物具有重要意义。本文就中草药拮抗内毒素及对脓毒症的治疗作用及作用机制的进展作一综述。

1 中和内毒素素作用

与内毒素结合后,通过抑制其活性或直接破坏内毒素的结构, 防止与机体效体细胞结合, 是治疗脓毒症的首要和关键措施。从中药中分离提取具有抗内毒素的单体化合物是实施中药现代化的主要目标,但是目前发现的具有直接中和内毒素作用的、来源于中药提取物的单体化合物报道得相对较少, 而且部分化合物尚不能最终确定其化学结构,如桅子、地骨皮、白鲜皮等的提取物[4,5]。吴晓云等[6]将板蓝根中分离出的31个化合物制成1 g/L溶液, 按细菌内毒素检查法作体外鲎试验, 结果显示3-(2' -羧基苯基)-4 -(3-H)喹唑酮、4-(3-H)-喹唑酮、丁香酸、邻氨基苯甲酸、水杨酸和苯甲酸等6种单体化合物具直接的体外抗内毒素作用。另外,研究显示甘氨酸、黄芩苷、五没食子酸葡萄糖[7]等在体外可以直接破坏内毒素的结构。

对内毒素具有直接灭活作用研究最多的是单味中药或中药复方制剂,其中研究最多且较系统的是板蓝根[8]。板蓝根可直接破坏内毒素的结构,电镜下显示内毒素结构由原有的链状变成了短片状或颗粒状。基质显色法显示, 板蓝根注射液稀释 2 500 倍仍能够使内毒素清除 70%以上。 刘云海[8]等比较了不同厂家生产的板蓝根注射液抗内毒素作用,发现其差别较大;并通过不同的提取方法对板蓝根进行分离提取,显示其氯仿提取物内含有较强的抗内毒素活性成分,进一步通过柱层析分离, 得到 4 个极性不同的成分F021、F022、F023和F024,分别用细菌内毒素检查法、热原检查法、对内毒素致小鼠毒性保护力、对内毒素致鼠巨噬细胞释放炎性因子抑制作用及内毒素定量检测等方法, 比较 4种成分的抗内毒素强度。结果显示板蓝根氯仿提取物中的F022抗内毒素作用最强,作者认为, F022是板蓝根抗内毒素新药研究的物质基础。

对中药拮抗内毒素作用的研究主要是通过鲎试验来判断的。但由于中药的产地、提取方法以及实验方法的差异,结果亦有所不同。 对40 种中草药的抗内毒素作用进行比较,发现金银花及其复方制剂能够降低绿脓杆菌攻击小鼠的死亡率;而其他的研究结果显示乌梅、连翘、大黄、蛇床子有明显拮抗内毒素的功效。刘志峰[9]比较了 8种中药注射剂,结果发现双黄连粉针剂、清开灵注射液、板蓝根注射液、穿琥宁注射液和鱼腥草注射液都有明显的体外抗内毒素作用, 其中双黄连、清开灵和板蓝根的抗内毒素作用最强, 复方大青叶注射液和抗腮腺炎注射液的体外抗内毒素作用较弱。目前报道的具有较强抗内毒素作用的单味中药有40多种, 如板蓝根、紫花、金银花、赤芍、连翘、黄芩等这些中药主要属于清热解毒类,与中医中药治疗脓毒症的理论基础相符。

许多复方制剂亦对内毒素具有直接破坏作用, 这些复方制剂主要由清热解毒类中药组成。如热毒平注射液、清解灵口服液、黄连解毒汤等可使内毒素链状结构裂解成杆状、片状,甚至完全降解。

2 抑制炎性介质释放

内毒素本身对机体损害并不严重, 其引起的SIRS或脓毒症主要是通过活化巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞等,释放大量的TNF-α、IL-1α、IL-6 等炎症介质导致机体的病理损害甚至死亡。 TNF-α、IL-1α、IL-6的水平, 与预后呈正相关, 实验证明动物单独注射TNF-α、IL-1α可出现几乎所有的内毒素的病理改变。因此, 对炎性介质释放的抑制或直接拮抗炎性介质亦是治疗脓毒症的重要手段。 许多单味中药及其复合制剂能够显著抑制由内毒素诱导炎性细胞因子释放[10],通过对炎性细胞合成、分泌细胞因子的双向调节作用、稳定溶酶体、抑制脂质过氧化反应、改善血液循环及免疫调节等作用, 抑制炎性细胞产生细胞因子达到抗炎目的。

大黄、大黄素,丹参、丹参素在体外能够抑制内毒素刺激的巨噬细胞释放TNF-α、IL-6、IL-8,且具有一定的量效关系, 同时大黄素和丹参素能激活单核吞噬细胞分泌细胞因子, 但所产生的量均显著低于由内毒素诱导所产生的量。 因此大黄素和丹参素可能具有双向调节作用, 一方面能抗炎,另一方面强机体的免疫功能。谭余庆[11]等通过实验研究认为探讨青蒿提取物通过降低脂质过氧化物(LPO)、酸性磷酸酶(ACP)、内毒素、 TNF-α浓度, 升高超氧化物歧化酶(SOD)活性等机制来发挥抗内毒素作用;邱海波[12]等认为雷公藤单体T4亦可呈剂量依赖性地抑制巨噬细胞释放TNFα、IL-1β、IL-6、IL-10、NO等。其他的报道[13]如桑色素能够抑制内毒素刺激动物巨噬细胞NO、TNF-a、IL-12的释放, 降低动物死亡率;千层纸黄素能够抑制内毒素RAW 264.7巨噬细胞。 NF-kB的活性, 进而抑制可诱导的一氧化氮合酶和环氧化酶的基因表达,减少NO生成;大黄素、大黄酸[14]显著的抑制内毒素刺激RAW 264.7 巨噬细胞NO、环氧化酶蛋白、PGE 2的生成等。

许多清热解毒复方制剂亦具有明显的抑制炎性介质的作用。热毒清(由金银花、大青叶、蒲公英、鱼腥草等中药制成的静脉注射液)能够降低内毒素攻击家兔血浆TNF-α、IL-6,进一步探讨热毒清抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)释放的分子机制, 结果显示热毒清能有效地控制内毒素刺激所引起的分泌型肿瘤坏死因子-α(sTNF-α)的高分泌, 虽然对TNF-α转换酶m RNA(TACEmRNA)表达无明显的抑制作用, 但对LPS刺激增加表达的TACEmRNA具有明显的抑制效果。其他中药复方制剂, 如中药912 液、中药合剂(丹参、大黄、白头翁、败酱草等)、厌氧灵(由黄连、黄芩、木通、大黄、甘草组成)等均显示能够抑制内毒素刺激下巨噬细胞分泌肿瘤TNF-α、IL-1、IL-6的释放,且具有一定的时效关系。

3 促进内毒素排出

肠道是人体最大的内毒素库, 机体在严重的创伤、感染等情况下, 可致肠黏膜屏障破坏, 引起肠源性感染和肠道内毒素移位, 加重毒血症。因此, 增强肠道屏障功能, 加快肠道内毒素的排出是抗内毒素的又一条途径。中医药在这方面主要是使用通里攻下、清热泻下的中药, 加速毒物排泄, 减少内、外源性内毒素吸收。这类中药主要是由大黄成的复方制剂,现代医学研究证实大黄具有抑制多种致病菌、促进肠蠕动、增加肠系膜血流量等作用, 有利于清洁肠道。通过对大承气汤及承气合剂(大黄、枳实、厚朴、白头翁、败酱草)、泻热汤(大黄、芒硝、元参、甘草)的研究, 一方面能够增强肠道蠕动,加速肠内容物排出, 另一方面通过免疫调节作用, 增强肝脏内毒素的廓清作用,而降低血浆内毒素水平。次秀丽[15]等观察到促动合剂(以厚朴、大黄等为主药组方)能够降低TNF-α和内毒素致休克模型大鼠肠黏膜通透性、细菌易位发生率及器官易位细菌数明显减少, 降低血NO、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、二胺氧化酶(DAO)活性及小肠组织DAO活性。

4 改善微循环

内毒素活化的巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞等释放大量的炎性介质、超氧阴离子等, 引起内皮细胞损伤、凝血功能紊乱等,造成微循环的障碍, 并最终导致多器官功能不全。中医药主要通过使用活血化淤、凉血化淤等药物, 增加红细胞膜抗损伤能力及流动性,抑制血小板功能、抗凝、增加纤维蛋白溶解活性、扩张血管、改善微循环、降低血液高凝状态,如人参,丹参、赤芍、当归等。符为民等观察地丹凉血注射液(水牛角、焦山栀、生地、丹皮、紫珠草、白茅根、丹参等)能够改善内毒素诱发DIC鼠的血流变化, 有效阻断红细胞过度凝集。复方丹参注射液能够降低全血黏度、血浆黏度、红细胞聚集指数和红细胞刚性指数。唐朝克等[16]探讨绞股蓝总皂苷(GPS)对注射内毒素的家兔血流动力学和继发DIC的影响,结果显示绞股蓝总皂苷能明显改善血流动力学指标, 降低血小板数和纤维蛋白原量。赵兴建观察归术破瘀汤对内毒素性DIC大鼠的结果显示:归术破瘀汤能使血小板数量增加,出、凝血时间和凝血酶原时间明显缩短, 纤维蛋白原浓度显著增加,且具有一定的剂量效应关系。

5 免疫调节作用

中药通过增强细胞免疫功能, 促进对内毒素的吞噬廓清能力,一方面增强机体的抗毒功能, 另一方面促进内毒素的代谢。中医药主要通过益气、扶正固本、生津养阴来实现这种作用。生脉注射液、参麦注射液等能够激活单核-巨噬细胞,增强吞噬功能。人参提取液[17]通过对机体反应的影响,改变机体应激状态, 提高机体对各种有害刺激的防御能力。黄芪[18]提取物能够增加脾B细胞产生免疫球蛋白, 诱导特异性细胞毒T细胞的形成, 而且能够一定程度增加TNF-a、IL-6分泌, 具有免疫调节活性。上述结果表明:增强单核-巨噬细胞的功能,加速其体内多种致病异物(包括内毒素)的清除以保持机体内环境的恒定, 可能是这类中药的一个共性。

虽然近年来对中草药拮抗内毒素的作用进行了大量的研究,但是这些研究大多数仅限于对中草药整体的药理作用研究,并不能明确其发挥内毒素拮抗作用的物质基础, 更不能从分子水平阐明其作用位点, 因此制约了中草药在内毒素拮抗方面的深入研究及临床使用。究其原因一方面可能由于单体成分的分离过程比较复杂繁琐,传统的中草药在提取有效部位过程中, 是在临床或药理试验的配合下, 将中草药用不同的溶剂进行萃取, 以确定其有效部位, 然后再逐步划分, 追踪有效成分最集中的部位, 再通过多次柱层析, 或通过HPLC法, 最终将中草药分出若干单体化合物,最后通过对每一单体的功能测试, 确定出所需的单体。这种方法虽然对一种中草药中具有某种活性的成分能够充分了解, 但操作复杂、繁琐,不利于进行大规模的研究。另一方面由于中草药在研究拮抗内毒素作用方面, 不能建立特异的筛选靶点, 使得分离工作缺乏针对性;再者, 传统的筛选是以鲎试验来判定某种成分是否具有中和内毒素的作用,由于中草药复杂的化学组成成分对鲎试剂的干扰,在结果的判断上容易出现假阳性或假阴性[19]。因此,有必要建立特异性的筛选靶点和准确的判定方法来加强单体抗内毒素化合物的研究。 近年来[20]第三军医大学西南医院综合实验研究中心通过应用生物传感器技术, 已经成功地从中药中分离到具有直接拮抗内毒素的活性单体。为从中草药抗内毒素药学作用物质基础的研究提供了一条快捷的方法。

因此, 通过加强对中草药抗内毒素作用的物质基础及其作用机制研究, 不仅对临床脓毒症的防治具有理论意义, 而且为寻找新的抗内毒素药物研究开辟了新的研究领域。

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