从靶标的多样性看核酸适配子在分子识别中的优势与前景

谭新颖，张焜和

（南昌大学第一附属医院 江西省消化疾病研究所，南昌 330006）

从靶标的多样性看核酸适配子在分子识别中的优势与前景

谭新颖，张焜和*

（南昌大学第一附属医院 江西省消化疾病研究所，南昌 330006）

20世纪90年代初，Tuerk等[1]建立了一种新的组合化学技术——指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），筛选到噬菌体T4 DNA聚合酶的RNA配体，即核酸适配子（aptamer）。核酸适配子能与生物靶分子高特异性和高亲和力结合，功能上与抗体类似，在分子识别研究中具有重要价值，目前在生物医学各个领域的相关研究中均有应用。SELEX技术自创立以来不断完善和发展，所用的筛选靶标从最初的蛋白质发展到目前的小到无机离子和多肽，大到细胞甚至组织，其靶标多样化程度远非制备抗体的抗原多样性可比拟，因而在分子识别中核酸适配子比抗体更具优势，应用前景更为广阔。本文在简要介绍SELEX筛选技术及其基本原理的基础上，就适配子筛选所用的主要靶标类型作一综述，从中可对适配子的优势和应用前景窥见一斑。

1 SELEX筛选过程及其基本原理

适配子SELEX筛选的基本过程是先人工合成库容量约1015的随机单链DNA文库，将其直接或转录为RNA后与靶标孵育，然后分离结合核酸并PCR扩增，制备成下一轮与靶标孵育的寡核苷酸文库。重复若干轮孵育－分离－扩增过程，最后将文库中能与靶标高特异性及高亲和力结合的单链寡核苷酸筛选并富集出来，克隆测序，鉴定其与靶分子结合的特异性和亲和力，选择能与靶分子高特异性和高亲和力结合者用于靶分子识别的相关研究。

单链随机寡核苷酸文库中的单链寡核苷酸两端约为20个碱基的固定序列（PCR引物结合区），中间为约30个碱基的随机序列。单链寡核苷酸因序列不同，可形成构象不同且热力学上非常稳定的二级和三级结构，如发卡、口袋、假结、G四聚体等。由于随机序列的存在，文库中的单链寡核苷酸因序列各异而形成多样而独特的空间构象，能与靶分子的空间构象形成“锁钥”关系，并通过氢键、疏水结构和离子键等与靶分子特异性结合。理论上，多达1014以上的随机寡核苷酸文库几乎涵盖了所有可能的立体构象，可为自然界存在的所有分子“配型”，找到特异性的核酸配体。

2 分子靶标

2.1 生物小分子

分子量小于10kD的生物小分子可以用作SELEX技术的靶标，筛出相应的适配子。Sassanfar等[2]以 ATP（分子量507.18）为靶标筛选出一组RNA适配子，Huizenga等[3]用ss-DNA文库也筛选到能与ATP结合的适配子，Lato等[4]筛选出了硼酸化ATP适配子。放射性核素硼（10B）可释放中子破坏周围细胞（范围为5～9μm，约一个细胞大小），较传统核素的放疗有优势，但目前缺乏10B特异性肿瘤细胞靶向分子，硼酸化ATP适配子可为硼中子的肿瘤靶向化疗提供新思路。

激素及神经递质多为小分子生物活性物质，通过SELEX技术可筛选出它们的核酸适配子。Bruno等[5]筛选得到乙酰胆碱（分子量146.21）的DNA适配子ACh 6R，可有效检测胆碱能细胞。Lévesque等[6]筛选到甲状腺素（分子量 776.93）的RNA适配子，能与甲状腺素(T4)和三碘甲腺原氨素(T3)特异性结合，但不结合包括甲腺原氨酸(T0)在内的无活性物质。Nieuwlandt等[7]成功筛选到一组P物质的RNA适配子，它们具有高度保守的二级结构，通过交叠的复杂结构与P物质进行紧密结合。P物质是一种含有11个氨基酸的多肽（分子量1.34kD），作为神经递质和神经调节物质在中枢及外周神经系统中起着多种重要作用。上述适配子对于这些小分子生物活性物质的含量检测、功能阻断具有潜在价值。

2.2 生物大分子 分子量10kD以上的生物大分子是SELEX筛选最常用的靶标，有众多相关的报道。

2.2.1 体液中的生物大分子 血液及其他体液中含有各种生物大分子，可作为SELEX筛选的良好靶标。血管内皮生长因子 （VEGF）是一种分子量为34～50kD的同源二聚体糖蛋白，广泛分布于各种组织，是促血管生成的重要因素。Jellinek等[8]筛选到一组能与VEGF特异结合的RNA适配子，亲和力达到pM水平，可以抑制VEGF与细胞表面受体结合。

免疫球蛋白是血液中一类重要的生物大分子，也可作为筛选靶标。Biesecker等[9]筛选到补体C5（分子量190kD）的一组适配子，其中7个与补体C5具有高亲和力（解离常数kd为20～40nM），能有效抑制人血清溶血反应和酵母多糖诱导的C5a产生。他们还在结构分析的基础上构建了一个特定碱基序列的随机RNA文库，进行了二次筛选，筛选出具有更高亲和力的适配子（解离常数为2～5nM），这些适配子在人类疾病的治疗中具有潜在应用价值。Mendonsa等[10]筛选到人IgE的DNA适配子，平均解离常数为29nM，能很好地区分人IgG和鼠IgE。

肿瘤标志物多为蛋白，存在于各种体液中，其核酸适配子的筛选可用于这些标志物的检测和肿瘤的分子诊断蛋白。MUC1是一种广泛存在于上皮细胞源性肿瘤的标志物，在肿瘤的诊断与免疫治疗中具有潜在应用价值。Ferreira等[11]筛选到一组MUC1的DNA适配子，其检测低限为1μg/ml，线性范围在8～100μg/m l，可以满足研发MUC1检测试剂的要求。

2.2.2 细胞膜蛋白 细胞膜上存在大量的蛋白质类功能分子，有的与胞膜的物质转运功能有关（如离子通道），有的与细胞辨认和接受环境中特异的化学性刺激有关（统称受体），有的与细胞的免疫功能有关 （如CD分子）。它们也可作为SELEX筛选的靶标。

Huang等[12]筛选到α-氨基羟甲基恶唑丙酸（AMPA）受体亚型GluR2的一组RNA适配子，具有稳定的物理特性，其中适配子AN58可与NBQX（最强的GluR2受体抑制剂）竞争结合GluR2受体。AMPA受体是一种谷氨酸离子通道亚型，过度激活可导致相应的离子大量内流而引起细胞损伤，与多种神经系统疾病有关，上述适配子对研制AMPA受体的水溶性抑制剂以治疗相关疾病具有重要价值。Toll样受体（TLR）家族在宿主抗微生物免疫中具有重要作用，其表达异常与免疫性疾病的发生关系密切。Chang等[13]筛选出TLR2受体的适配子，其中一个适配子的Kd值仅为73pM，能有效阻断TLR2，对相关细胞因子分泌水平抑制程度达80%以上，对TLR2功能异常具有潜在的治疗价值。

以免疫细胞表面的免疫相关分子为靶标可筛选出调控免疫功能的核酸适配子。McNamara等[14]筛选到小鼠共刺激分子4-1BB的适配子，在体外能共刺激T细胞活化，体内能抑制小鼠的肿瘤生长。Kraus等[15]以重组sCD4为靶标筛选出一组RNA适配子，能敏感而特异地结合CD4分子，与CD4单抗具有相似的免疫抑制作用。

2.2.3 病原微生物蛋白或产物 因缺乏有效药物，病毒成为目前对人类健康危害最大的病原微生物，不少研究以病毒的功能蛋白为靶标筛选相应的适配子，以期为病毒的诊治提供新的手段。

人免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的Rev蛋白作为一种核质穿梭蛋白，对病毒的复制起关键作用。Tuerk等[16]筛选出特异性的HIV Rev蛋白的RNA适配子，结构分析显示适配子的两个区域能够与Rev蛋白特异结合。Li等[17]筛选到发生耐药变异的HIV逆转录酶的适配子，只特异性结合变异的逆转录酶，可用于耐药变异HIV的检测和治疗。

Lee等[18]以丙型肝炎病毒（HCV）核心抗原为靶标筛选到的RNA适配子只与核心抗原特异性结合，不与非结构5区（NS5）蛋白结合，可用于检测血清中的HCV核心抗原而诊断HCV感染。Fukuda等[19]筛选的适配子能与HCV非结构蛋白NS3酶活性位点(△NS3)特异性结合，并能抑制其90%的酶活性，具有潜在治疗价值。

人类流感病毒表面表达的血凝素(HA)是决定流感病毒A、B型的关键标志，可据此鉴别病毒亚型，对临床诊断及流行病学研究十分重要。Subash等[20]成功筛选出B型人类流感病毒的HA特异性适配子，与A型病毒株的HA无结合能力。Cheng等[21]筛选出禽流感病毒株H5N1的重组体HA1蛋白的一组DNA适配子，其中一个适配子具有较强的亲和力且能抑制H5N1病毒复制，为开发预防禽流感药物以及控制其传播提供了新思路。

正常朊病毒蛋白PrP(C)和病态朊病毒蛋白PrP(Sc)尚缺乏敏感、特异的试剂来区分。Bibby等[22]应用鼠类朊病毒蛋白质重组体为靶标，筛选到24个高亲和力的ssDNA适配子，其中4个适配子能特异性与鼠朊病毒蛋白质结合，大多数同时也能和人和羊的朊病毒蛋白质结合，解离常数8～79 nM不等，为后续的朊病毒蛋白的检测分析奠定了基础。

结核杆菌分泌的早期分泌抗原靶6(early secretary antigenic target-6,ESAT-6)在抗结核分支杆菌感染的免疫应答中起重要作用，可将ESAT-6作为区分结核分支杆菌感染和卡介苗接种或环境分枝杆菌感染的特异性抗原。马占忠等[23]以ESAT-6为靶蛋白筛选出ssDNA适配子，为结核病诊断和治疗药物的开发奠定了基础。

2.3 化学药物 化学药物分子量小，难以制备相应的抗体，但却可以作为靶标筛选相应的适配子，用于药物检测分析。

四环素类是在四环素化学基团5,6位碳原子上存在差异的一类抗生素，例如氧四环素（土霉素）和去氧四环素（阿霉素）等。Niazi等[24]利用氧四环素、去氧四环素和普通四环素分别做靶标和反筛靶标，筛选出了20个四环素基团特异的ss-DNA适配子，其中7个对普通四环素主链有较高的亲和力（Kd=63～483 nM），对四环素同型异构体的特异性结合的程度为氧四环素>四环素>阿霉素，这种四环素特异性适配子可用于靶药物转运和四环素制备中的检测及纯度分析。

环孢霉素A(cyclosporin A，CsA)是含11个氨基酸的环状多肽，为器官移植后临床常用的免疫抑制剂，有较严重的肝、肾毒性，故定期监测病人血液中CsA的浓度，对减少或避免毒副反应、保证疗效、提高移植病人的存活率至关重要，但传统的荧光偏振免疫法和高效液相色谱法检测存在着成本高等问题，李卫滨等[25]筛选到针对CsA的ssDNA特异性适配子，为建立检测血液CsA浓度的快速而简便检测方法奠定了基础。

3 微生物靶标

完整的病毒颗粒、细菌都可以是适配子筛选的靶标，可同时筛出与多个位点结合的适配子，是一种高效的复合筛选。Nitsche等[26]以牛痘病毒为靶标筛选出DNA适配子，能抑制牛痘病毒及其他痘科病毒感染，具有浓度依赖性。Chen等[27]筛选到结核菌株 (H37Rv)的高亲和力和高特异性适配子NK2，与H37Rv结合后可只促进CD4+T细胞分泌IFN-γ；体内注射NK2可使感染H37Rv小鼠的寿命明显延长，脾脏的细菌数明显减少，肺组织的肺泡融合和肿胀减轻。甄蓓等[28]以炭疽芽孢杆菌疫苗株A.16R芽孢为靶标，筛选获得的适配子文库的亲和力是原始文库的37倍，二级结构分析显示这些适配子通过5’端的茎-环和发卡结构与靶标结合，而临近碱基的三级结构则维持其稳定性，有可能成为一种有效的炭疽杆菌的分子诊断工具。还有人筛选出葡萄球菌、淋病奈瑟菌等其它细菌适配子。

4 真核细胞靶标

以活的真核细胞为靶标，可进行所谓的Cell-SELEX，筛选出细胞表面分子的适配子。Cell-SELEX具有简单、高效、直接、可重复等特点，最大的优点是无需特定靶分子的相关知识，因而在恶性肿瘤的诊断及生物标志物研究方面具有良好的前景。目前主要以肿瘤细胞为靶标进行此类筛选。

白血病细胞以单细胞状态存在于血液中，是Cell-SELEX的理想靶标。Shangguan等[29]用人类急性T淋巴细胞性白血病(T-ALL)的CCEF-CEM细胞株作为靶细胞，人类B细胞系淋巴瘤CRL-1596细胞株为阴性细胞（反筛），筛选出一组核酸适配子，能够特异地识别靶细胞，而不与正常造血细胞、淋巴瘤和骨髓瘤细胞结合。他们在对适配子的后续分析中，发现白血病细胞高表达跨膜蛋白——蛋白酪氨酸激酶 7 (PTK7)，并认为是T-ALL的特异性生物标记物[30]。

实体瘤细胞也可作为Cell-SELEX筛选的靶标。Chen等[31]以小细胞肺癌细胞为靶标筛选到的多个适配子，能高亲和力和高特异性结合不同来源的肺癌细胞（包括来自于肺癌标本者）；将适配子与磁性荧光纳米粒联结后，可从含有混合细胞的培养基中分离、富集和敏感地检测靶细胞。Shangguan等[32]以源于小鼠肝细胞的MEAR肝癌细胞系靶标，用BNL肝细胞系进行消减筛选（MEAR由BNL经化学诱导而得），获得纳摩水平亲和力的肝癌细胞株MEAR的特异性适配子，能在小鼠模型中与肝癌细胞特异性结合。这项结果提示癌细胞特异性适配子将有可能成为体内诊断与治疗的靶向分子。

5 结束语

核酸适配子与抗体相似，都可用于靶分子的识别，且敏感性和特异性有时好于抗体。在两者的制备过程中，核酸适配子在靶标上有明显的优势。筛选适配子的靶标可以小到无机分子，大到完整的活细胞，甚至组织[33]，而制备抗体的靶标主要为蛋白质，且必须具有免疫原性，但不能有毒。相比之下，两者所针对的靶分子范围相差甚远。不仅如此，核酸适配子的制备过程本身也较抗体更简单、不需要体内过程、耗时更短、可人工合成。此外，从适配子与抗体之间理化性质的差异也可看到核酸适配子的优势，如性质稳定、无免疫原性、分子量较小。因而核酸适配子的筛选与应用研究已应用于医学的各个领域，如基础研究、临床诊断、疾病治疗和药物研发等方面。可以预见，核酸适配子的筛选靶标会进一步丰富，所涉及的领域会进一步扩展，在医学中应用前景会更加广阔。

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Q74

B

1674-1129(2010)02-0161-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2010.02.023

江西省科技攻关项目（20061B03032400）；江西省卫生厅重大指标项目 （20074001）；江西省教育厅科技项目（2006061）；江西省研究生创新基金项目（YC07A022）

*通讯作者