利胆排毒口服液对大鼠胆汁及尿液中内毒素含量的影响

常明向 吴梅梅 刘浩

近20年来，内毒素的研究已成为医学科学研究中最为活跃的领域之一。内毒素存在于革兰氏阴性菌胞壁外膜，在细菌死亡、裂解后释放出来，大量内毒素进入血循环系统则产生内毒素血症。在化疗药物十分发达的今日，内毒素血症仍是革兰氏阴性细菌败血症死亡率达50%左右的主要原因，还是许多危急难治性疾病如急性肺衰、肾衰、肝衰、急性弥散性血管内凝血等的主要病因。内毒素血症可造成广泛的病理反应，如多器官功能不全综合征、弥散性血管内凝血、多脏器功能衰竭及休克等,是一种现代复杂难治性疾病。

根据最新国内外研究成果，结合传统中医理论，在茵陈蒿汤与调胃承气汤合方的基础上进行加减，研制出了一个新复方制剂——利胆排毒口服液。该方具有保肝利胆、通俯排毒、益气活血、清热解毒的功效，用于治疗内毒素血症。研究表明，该制剂对内毒素血症小鼠保护率达100%。为进一步研究该制剂对内毒素的体内灭活作用，本课题研究了其对大鼠胆汁流量的影响，对大鼠胆汁及尿液中内毒素含量变化的影响。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

自制利胆排毒口服液(含茵陈、栀子、大黄、甘草、芒硝等药味), 每毫升含生药量1 g。内毒素(LPS， E.ColiO111B4， 5 mg/支，购自Sigma)，临用前用生理盐水配成1 mg/ml的溶液。无热原试管，洁净试管使用前在马辐式炉中经250℃高温烘烤3小时。无热原枪头(购自北京金山川公司)。内毒素测定试剂盒(上海伊华公司)。

1.2 动物

Wister大鼠，体重180～200 g ,雄性(购自中科院武汉实验动物中心)。实验前15小时禁食不禁水。

1.3 胆汁收集与流量测定

取雄性大白鼠8只, 每鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥进行麻醉, 然后仰位固定于大白鼠解剖台上,再沿腹中线切口, 打开腹腔, 翻转十二指肠, 找到胆管, 在胆管下穿线, 结扎乳头部, 向肝脏方向作“V”形切口, 插入塑料管, 可见有淡黄色胆汁流出, 结扎固定, 待胆汁流出稳定后, 观察药前20分钟内胆汁流出的总滴数作为对照, 再向十二指肠管内注射利胆排毒口服液1 ml/100 g体重, 从给药后20分钟开始观察纪录第20～40分钟, 40～60分钟内胆汁流出的总滴数, 与用药前比较, 两组数据间的比较用t检验，进行统计学处理,P<0.05为差异有显著性。

1.4 胆汁收集与内毒素含量测定

1.4.1 胆汁收集 取雄性大白鼠10 只, 随机分为两组，一组作对照组，一组作用药组。胆汁收集实验操作同1.3项下，并收集胆汁于无热原试管中。对照组每鼠于十二指肠注入生理盐水1 ml/100 g体重后，先收集30分钟的胆汁作为空白，然后尾静脉注射内毒素溶液0.1 ml/100 g，再收集1小时的胆汁。用药组每鼠于十二指肠注入利胆排毒口服液1 ml/100 g体重，先收集30分钟的胆汁作为空白，然后尾静脉注射内毒素溶液0.1 ml/100 g体重，再收集1小时的胆汁。

1.4.2 尿液收集 1.4项下大鼠胆汁收集完毕后，取出膀胱收集尿液。

1.4.3 样品处理及内毒素的测定 将收集的胆汁以等量无热原水和0.4 ml/L的TRIS-HCL缓冲液稀释400倍，将尿液同法稀释10倍，并以3500 rpm离心10分钟。分别取上清液0.1 ml, 加入鲎试剂0.05 ml,混匀，37℃温育25分钟；加入鲎三肽0.05 ml, 混匀，37℃温育3分钟，然后，依次加入0.5 ml亚硝酸钠、0.5ml氨基苯磺酸、0.5 ml萘乙二胺进行显色反应。按试剂盒要求，同时设空白对照和内毒素标准液对照。反应完毕后，以蒸溜水为空白, 在分光光度计上以545 nm 比色。与用药前比较, 两组数据间的比较用t检验，进行统计学处理,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 口服液对胆汁分泌的影响

给药前20分钟内，胆汁流出总滴数为(15.5±3.5)滴, 给药后20～40分钟较药前增加(4.5±1.5)滴,(P<0.05);给药后40～60分钟较药前增加(5.5±2.5)滴,(P<0.05)。说明利胆排毒口服液有显著的促进大鼠胆汁分泌的作用。

2.2 口服液对大鼠胆汁及尿液中内毒素含量的影响

对照组及口服液组大鼠胆汁中内毒素含量结果分别为(84.3±12.1)EU/ ml，(51.7±14.4)EU/ ml,P<0.05；对照组及口服液组大鼠尿液中内毒素含量结果分别为(17.2±2.1)EU/ ml，(12.5±1.6)EU/ ml,P<0.05。

3 讨论

内毒素机体清除机制研究已表明，肝是清除内毒素的主要器官，脾、肠也是重要器官。肝对血液中内毒素的清除，主要是通过枯否细胞、肝细胞的内吞作用而实现的。内毒素被内吞入细胞后，以微管依赖的囊泡运输方式，穿过肝细胞，运至肝细胞胆小管面，以胞吐的方式排入胆小管中，再经胆道系统排入肠腔内。免疫组化显示，从血液循环中清除的内毒素迅速分布到肝、肺、肾等组织巨噬细胞内。内毒素及其代谢产物经巨噬细胞代谢转运后可逐步由胆道排泄，采用酚/水抽体法从内毒素血症大鼠胆汁中排出的内毒素，发现它对小鼠仍具极强致死活性[1]。但从目前文献看，对泌尿道排出内毒素是否是机体清除内毒素的方式与途径未得到认同，不过现有不多的研究资料已显示，尿液中确实含有较高浓度的内毒素[2,3]。因此，研究胆汁及尿液中内毒素的含量变化对了解机体清除内毒素的功能具有重要意义。

实验结果表明，利胆排毒口服液给大鼠注入后能促进大鼠胆汁分泌, 表明该制剂具有利胆作用。实验也表明，大鼠注射内毒素后，胆汁中确实存在大量的内毒素。在病理情况下如胆道阻塞不通畅，则会使内毒素停留于体内，引发或加重内毒素血症。因而，利胆排毒口服液的利胆作用将促进内毒素的排出，增强机体清除内毒素的能力，从而有助于内毒素血症的治疗。

结果表明，用药后大鼠胆汁及尿液中内毒素含量均降低，其原因可能是中药直接降解内毒素，使循环中内毒素量减少，从而导致排出减少；另一种原因是中药的利胆作用，使胆汁分泌增加，单位体积内内毒素含量下降。

尿液中内毒素含量测定表明，尿液中也存在一定量的内毒素，文献资料及本研究结果可以说明，泌尿道排出内毒素也应是机体清除内毒素的方式与途径之一。中药的利尿作用也将有助于内毒素血症的治疗。

[1]Van Bossuuyt H,De Zanger RB,Wisse E. Cellular and subcellular distribution of injected lipopolysaccharide in rat liver and its inactivation by bile salts[J]. hepatol ,1988,7:325-337

[2]刘竟，崔乃强，赵琪,等. 肠源性内毒素移位后的体内分布[J].中国急救医学, 2000,20(3) :146-147.

[3]卜一珊，徐彦贵，郭震，等. 动态浊度法测定尿液中内毒素含量及临床应用[J].中国医院药学杂志.2003，23(6)：335-337.