肿瘤干细胞耐药机制及对策

孙芬芬 综述,叶小群审校

(南昌大学第二附属医院呼吸科,江西 南昌 330006)

肿瘤治疗的障碍之一是出现多药耐药(multidrug resistance,MDR),多数化疗方案可以消灭大部分肿瘤细胞但始终缺乏从根本上铲除肿瘤的方法。对肿瘤多药耐药发生机制的研究和寻找开发逆转耐药的药物是当前肿瘤化疗研究的重要课题。近年来,科学家陆续从实验中找到并分离出肿瘤干细胞而提出“肿瘤干细胞假说”,这一假说为肿瘤治疗开拓了新思路。随着对肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)研究的深入,发现CSCs和正常干细胞有很多相似之处,如同样具有自我更新和分裂增殖能力、耐药、DNA修复活性和抗凋亡等。其耐药性帮助CSCs抵抗化疗药物的毒性作用,从而为肿瘤增殖和复发留下“种子”。本文就CSCs及其耐药机制相关研究进行综述。

1 CSCs的概念

CSCs的概念由 Lapidot等在 1994年首次提出,认为在瘤体内存在类似于干细胞功能的一类细胞群体.将这类具有形成肿瘤能力的细胞群体称为CSCs。Bonnet等首先分离出类似正常干细胞的白血病干细胞,体外培养和动物实验证明其具有成瘤能力。实体瘤干细胞的分离最早是2003年A1-Hajj等从乳腺癌细胞中分离鉴定出具有干细胞类似生物学特性的细胞群体。采用类似的研究方法,其他实体瘤CSCs也被陆续分离出来。

通过对多药耐药的长期研究,研究人员已经找到了一群与肿瘤多药耐药相关的蛋白,其中ABC转运蛋白被发现与CSCs密切相关。人类多药耐药基因1(MDR1基因)编码P-糖蛋白(P-gp/ABCB1),其作用是作为各种抗癌药物外排泵。最近研究表明雌激素能下调乳腺癌耐药蛋白(BCRP/ABCG2)的表达和多药耐药基因转导P-gp的表达水平,因此调节P-gp的表达水平在乳腺癌的治疗中可能是一种有效的策略[1]。深入理解多药耐药的分子基础和开发临床试剂及治疗策略是防止耐药性发生的关键[2]。

2 CSCs的耐药机制

CSCs是造成肿瘤耐药的最根本原因。现有治疗肿瘤的方法主要是针对肿瘤组织内的大多数细胞,而不是CSCs。CSCs多处于细胞G0期,具有很高的端粒酶活性及DNA复制修复能力,通过高表达ABC转运蛋白和抗凋亡基因等而逃避化疗及放疗,最终导致肿瘤复发和转移。

2.1 ABC转运蛋白的药泵作用 三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC转运蛋白)是一类跨膜蛋白,可转运肽类、内源性脂类、核苷酸、药物霉素等。目前研究较深入的ABC转运蛋白主要有 ABCB1、ABCC1、ABCG2。它们利用ATP分解产生的能量主动将细胞内的药物泵出降低细胞内药物浓度,从而保护自身免受细胞毒性药物的损伤,对化疗不敏感。Kondo等[3]研究认为在体外已经建株的肿瘤细胞系中也存在具有干细胞功能相类似的细胞群体,将该类细胞群称为SP(side population)细胞。SP细胞最初是Goodell等在用DNA染料Hoechst33342为鼠造血干细胞染色并进行荧光活化细胞分选系统分选时发现的,其染色偏低。研究表明SP细胞染色偏低的原因是其细胞膜上的 ABCG2将 Hoechst33342泵到细胞外。研究还发现不同组织来源的SP细胞均表达ABCG2/Bcrpl,其功能被认为与参与肿瘤细胞的多药抗性有关。Zhou等[4]对SP细胞在胰腺癌细胞系PANC-1中的作用及耐药机制的研究中发现,SP细胞固有的高抗化疗药物有助于肿瘤的复发。Jin等[5]在神经胶质瘤干细胞中证实有ABCG2表达且其表达水平与神经胶质瘤的病理分级呈正相关,研究还发现ABCG2在神经胶质瘤对米托蒽醌等化疗药物产生耐药中起关键作用。

2.2 高水平表达抗凋亡基因 诱导细胞凋亡是众多化疗药物杀伤肿瘤细胞的共同机制。bcl-2是一类新的癌基因家族,按其对凋亡的调节功能可分为抑制凋亡基因(如 bcl-2,bcl-x,bclw,Mcl-1,AL/Bfl-1等)和促进凋亡基因(bax,bcl-xs,bad,bak,等),其过度表达使化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用转变为对细胞死亡的抑制而耐药。除bcl-2外,CSCs也持续表达一些其他抗凋亡基因参与耐药,如死亡相关蛋白激酶(DAPK)。DAPK是一种钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,负责启动诱导程序性细胞死亡,其启动子区CpG岛高甲基化使基因转录沉默而失去功能,与肿瘤细胞的形成转移有关等原因备受人们的关注。新近一项关于胃癌的研究结果表明,DAPK基因启动子甲基化在胃癌癌前病变和早期胃癌的发病机制中发挥着重要作用[6]。

2.3 DNA复制和修复机制 DNA作为多种抗癌药物攻击的靶分子,其损伤修复能力异常与肿瘤的耐药性形成有密切关系。DNA修复机制主要有:碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、错配修复(MM R)、同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)。新近有关错配修复蛋白的研究日益受到重视,错配修复蛋白是一组高度保守的生物大分子,在维持基因组稳定中起重要作用。目前认为主要通过以下途径导致肿瘤发生:(1)MM R基因自身发生突变,失去错配修复功能,在DNA复制过程中产生大量的复制错误及微卫星不稳定。在结直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤等多种肿瘤中发现错配修复蛋白基因突变与微卫星不稳定的关系[7]。(2)错配修复蛋白功能缺陷导致细胞突变,引起癌基因、抑癌基因突变,如基因易位、扩增、染色体丢失等,突变癌细胞群体持续优势生长,促进肿瘤形成。(3)错配修复蛋白功能缺陷可通过一些致癌物如烷化剂引起DNA损伤,导致肿瘤形成。(4)错配修复蛋白参与细胞周期的调控,其缺陷可导致细胞周期改变,从而引起肿瘤的发生[8]。

2.4 自我更新能力 人们认为肿瘤不断生长的另一个重要原因是干细胞的自我更新。Bim-1、Notch、Shh、Wnt等信号通路对CSCs的自我更新发挥着重要作用。Hedgehog信号通路是调控胚胎组织分化发育过程中重要的决定因素,主要有信号分子Shh、膜受体patched(PTCH)、smoothened(Smo)、一些中间传递分子和核转录因子Glis组成[9]。一般认为Hedgehog信号的活化只有通过激活膜蛋白Smo才能实现信号的传递,但在成熟组织的更新和维持中Hh信号传导通路的功能机制尚未确定。Zhao等[10]研究发现Smo受体的缺失是通过BCRABL1蛋白的作用来损害造血干细胞的更新和减少对慢性骨髓源性白血病(CM L)的诱导,此外Hh信号传导通路的抑制剂还减弱了小鼠和人类CML对伊马替尼的耐药性。

2.5 端粒酶活性增高 端粒酶是一种能够催化延长端粒末端的核糖核酸蛋白复合物,具有逆转录酶活性,由一个端粒酶催化亚基(TERT)和模板RNA(TR)组成,能够以自身携带的RNA为模板逆转录合成端粒DNA并添加于染色体末端维持端粒长度的稳定,保持染色体的动态平衡。端粒酶的重新活化可能是正常体细胞向肿瘤转化的关键步骤。研究表明除一些更新组织的增殖细胞如生殖细胞、造血干细胞、表皮基底细胞等之外正常体细胞无端粒酶活性或不表达TERT。90%以上的恶性肿瘤细胞尤其是CSCs高表达TERT并且有很高的端粒酶活性。研究表明,苏拉明(suramin)抑制端粒酶的活性呈剂量依赖性,在250 microM和175 microM时苏拉明明显抑制端粒酶的活性和脑胶质瘤C6球体的增长及细胞增殖[11]。在癌变和耐药性中端粒酶作为潜在治疗策略引起越来越多的关注。

除上述机制外,CSCs还存在其他耐药机制,如干细胞通常处于G0期,故对那些靶向细胞增殖周期的药物耐药,此外还有DAN拓扑异构酶发生活性改变使抗癌药物的靶点减少或过表达达到多药耐药等。

3 克服CSCs耐药性策略

CSCs概念的提出提供了选择性杀伤CSC的靶分子疗法,可以克服耐药性从而防止肿瘤治疗后复发与转移。根据CSCs的生物学特性,目前已有一些治疗肿瘤的方法和思路。

3.1 ABC转运蛋白抑制剂 ABC转运蛋白抑制剂的应用是源于对ABC转运蛋白功能的认识,第1、2代ABC转运蛋白抑制剂临床效果不佳其主要原因在于其与化疗药物药代动力学相互影响,然而即便是如此,ABC转运蛋白抑制剂的研究还是取得了一定进展。tariquidar(XR9576)是邻氨苯甲酸的新型衍生物,也是目前被认为最有希望治疗肿瘤的非竞争P-gp抑制剂,它能抑制 P-gp的ATP酶活性,临床实验联合阿霉素、长春新碱及紫杉醇等药物有良好逆转肿瘤细胞耐药性的效果[12]。Hu等[13]研究发现Akt信号通路能够调节SP细胞的药物外排活动,其机制是改变ABCG2蛋白亚细胞的定位,同时还证明了抑制Akt信号通路可以减少阿霉素从MHCC-97L细胞中的泵出从而增加药物的疗效。

3.2 靶向治疗 CSCs胞膜内存有特异性细胞因子,将药物以纳米材料及共价键结合方式特异性地定点于靶细胞,从而特异性针对靶定CSCs进行治疗。恶性肿瘤生长、转移均依赖新生血管生成,抗血管生成治疗也因其具有高效性、不易产生耐药性及无明显毒副反应等优点成为当今肿瘤治疗领域的热点。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是针对内皮细胞特异性最高、促血管生长作用最强的一种因子,可能在多种血管生长因子中起着中心调控作用,因此多数研究将VEGF或其受体作为治疗的靶点。近年来利用RNA干扰技术进行的抗肿瘤血管治疗受到广泛重视,RNA干扰为dsRNA在mRNA水平上阻止相关基因表达的过程,是一项新兴的基因阻断技术。Mulkeen等[14]在结肠癌的研究中发现VEGF的siRNA可以沉默VEGF的表达且通过影响这一表达减少结肠癌细胞的增殖。

3.3 免疫诱导 免疫诱导的原理主要是用CSCs表面特异性表达的表面抗原,诱导自身机体对肿瘤细胞产生细胞免疫和体液免疫,杀伤带有干细胞抗原的肿瘤细胞。前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCA)是前列腺细胞特有的,PSCA在肿瘤生物学和临床预后上是一种有效的预测指标,在LAPC-9癌裸鼠模型中证实了单克隆抗体(mAb)1G8与PSCA特异性结合有显著抗肿瘤作用,这种抗体有希望成为临床试验中的靶向治疗策略[15]。

3.4 诱导分化 干细胞的自我更新、增殖、分化主要依赖于其生存的特殊微环境(niche)。CSCs可能存活在异常的niche中,打破这种异常的niche就能减弱CSCs的自我更新,从而抑制肿瘤的生长。通过靶向CSC微环境抑制血管生成,或改变微环境来诱导CSC分化[16]。现已证实全反式维甲酸可诱导分化治疗急性髓性白血病(AML),并对其他肿瘤也有一定疗效。Hallaert等[17]报道c-Abl激酶抑制剂(伊马替尼或达沙替尼)可显著减少由CD40介导的耐药性慢性骨髓源性白血病细胞的增殖,其可能作用机制是通过c-Abl激酶抑制剂影响干细胞特性的微环境而诱导LSC分化。也可通过细胞因子等促使CSCs分化,然后加用增殖期化疗药物杀死肿瘤细胞。

3.5 抑制端粒酶活性 目前研究比较广泛的端粒酶抑制剂主要有反义寡核苷酸(ASODN)、小分子干扰 RNA(siRNA)、锤头状核酶、逆转录酶抑制剂等,其中RNA干扰技术由于长期高效的基因沉默效果,特异性强、快速持久而备受青睐。RNA干扰是由短的双链RNA诱发的基因沉默,与该双链 RNA有同源序列的mRNA被降解,从而阻止特定基因的表达。siRNA是比较广泛的端粒酶抑制剂[18]。采用HT ERT的siRNA转染入乳腺癌细胞株中,发现能有效地下调HT ERTmRNA的表达,降低了端粒酶的活性,同时使癌细胞群落减小。研究还发现低剂量阿霉素和siRNA联合应用能更有效地抑制端粒酶的活性,而且还可加强和持久性诱导乳腺癌细胞凋亡[19]。

3.6 干细胞移植的应用 造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplant,HSCT)泛指将各种来源的正常造血干细胞在患者接受超剂量化(放)疗后,通过静脉输注移植入受体内,以替代原有的病理性造血干细胞,从而使患者正常的造血及免疫功能得以重建。异基因干细胞移植(allo-HSCT)是治疗造血系统恶性疾病、代谢疾病和自身免疫疾病的一种方法。丁邦和等[20]采用FBCA方案(氟达拉宾加马利兰加环磷酰胺加Ara-c)对12例恶性血液病患者预处理行异基因干细胞移植,移植后第30天开始给予淋巴细胞(DLL)输注,结果证明非清髓性异基因干细胞移植(non-myeloablative allogeneic stem cell transplantation,NAST)联合DLL治疗恶性血液病安全可靠,造血功能恢复迅速且持久稳定,长期无病生存率高,急性移植物抗宿主病(GVHD)发病率低。

4 展 望

CSCs概念的提出,是人们认识肿瘤和治疗肿瘤的新突破点。进一步研究CSCs耐药相关的细胞生物学、分子生物学改变以及异常信号转导通路的组成,是CSCs靶向治疗的基础。目前对于CSCs的治疗还有些急需解决的问题,如应该如何特异性标识CSCs表面标记物以更好地分离和鉴定CSCs;怎样才能保证药物能特异性杀死CSCs而不影响其他正常干细胞以及控制HSCT的不良反应和降低其使用风险等,对这些问题的探索还需要进行长期的科学研究和论证。

[1] Mutoh K,Tsukahara S,Mitsuhashi J,et al.Estrogen-mediated post transcriptional down-regulation of P-glycoprotein in MDR1-transduced human breast cancer cells[J].Cancer Sci,2006,97(11):1198.

[2] Dean M.ABC transporters,drug resistance,and cancer stem cells[J].J M ammary Gland Biol Neoplasia,2009,14(1):3.

[3] Kondo T,Setoguchi T,Taga T,et al.Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(3):781.

[4] Zhou J,Wang CY,Liu T,et al.Persistence of side population cells with high drug efflux capacity in pancreatic cancer[J].World J Gastroenterol,2008,14(6):925.

[5] Jin Y,Bin ZQ,Qiang H,et al.ABCG2 is related with the grade of glioma and resistance to mitoxantone,a chemotherapeutic drug for glioma[J].J Cancer Res Clin Oncol,2009,135(10):1369.

[6] Zou XP,Zhang B,Zhang XQ,et al.Promoter hypermethylation of multiple genes in early gastric adenocarcinoma and precancerous lesions[J].Hom Pathol,2009,40(11):1534.

[7] Yoon BS,Kim YT,Kim JH,et al.Clinical significance of microsatellite instabilityin sporadic epithelial ovarian tumors[J].Yonsei Med J,2008,49(2):272.

[8] Schroering AG,Edelbrock MA,Richards TJ,et al.The cell cycle and DNA mismatch repair[J].Exp Cell Res,2007,313(2):292.

[9] Huangfu D,Anderson KV.Signaling from Smo to Ci/Gli:conservation and divergence of Hedgehog pathways from Drosophila to vertebrates[J].Development,2006,133(1):3.

[10]Zhao C,Chen A,Jamieson CH,et al.Hedgehog signalling is essential for maintenance of cancer stem cells in myeloid leukaemia[J].Nature,2009,458(7239):776.

[11]Erguven M,Akev N,Ozdemir A,et al.The inhibitory effect of suramin on telomerase activity and spheroid growth of C6 glioma cells[J].Med Sci Moint,2008,14(8):165.

[12]Fox E,Bates SE.Tariquidar(XR9576):a P-glycoprotein drug efflux pump inhibitor[J].Expert Rev Anticancer T-her,2007,7(4):447.

[13]HU C,Li H,Li J,et al.Analysis of ABCG2 expression and side population identifies intrinsic drug efflux in the HCC cell line M HCC-97L and its modulation by Akt signaling[J].Carcinogenesis,2008,29(12):2287.

[14] Mulkeen AL,Silva T,Yoo PS,et al.Short interfering RNA-mediated gene silencing of vascular endothelial growth factor:effects on cellular proli-feration in colon cancer cells[J].Arch Surg,2006,141(4):367.

[15]Li Y,Cozzi PJ,Russell PJ,et al.Promising tumor-associated antigens for future prostate cancer therapy[J].Med Res Rev,2009,18(Epub ahead of print).

[16]Yang ZJ,Wechsler-Reya RJ.Hit′em where they live:targeting the cancer stem cell niche[J].Cancer Cell,2007,11(1):3.

[17]Hallaert DY,Jaspers A,van Noesel CJ,et al.c-Abl kinase inhibitors overcome CD40-mediated drug resistance in CLL:implications for therapeutic targeting of chemoresistant niches[J].Blood,2008,112(13):5141.

[18]Shammas M A,Koley H,Baiehu RB,et al.Telomerase inhibition by siRNA causes senescence and apoptosis in Barrett,s adenocarcinoma cells:mechanism and therapeutic potential[J].Mol Cancer,2005,15(4):24.

[19]Dong X,Liu A,Zer C,et al.siRNA inhibition of telomerase enhances the anti-cancereffect of doxorubicin in breast cancer cells[J].BMC Cancer,2009,5(9):133.

[20]丁邦和,李玉峰,钱芳.非清髓性异基因造血干细胞移植联合供着淋巴细胞输注治疗恶性血液病[J].临床肿瘤学杂志,2008,13(6):545.