分子标记在长豇豆遗传分析中的应用进展

张静，彭海，陈禅友

（江汉大学生命科学学院，湖北武汉，430056）

豇豆（Vigna unguiculataL.Walp.）是一种重要的豆科植物，全球种植面积超过12 500万hm2，年产量超过300万t[1]。豇豆起源于非洲，传入亚洲后，在中国与印度分别形成了长豇豆（V.sesquipedalis）与短豇豆（V.cylindrica）2个栽培亚种，另外有1个亚种为普通豇豆（V.unguiculata），故栽培豇豆共有3个亚种。其中，长豇豆是豇豆中经济性上很重要的一个亚种，可菜用，还可作动物饲料[2]，因而被广泛种植于东南亚与中国各地。中国是长豇豆的次生起源中心[3]，具有悠久的栽培历史。中国地域辽阔、生态环境复杂，长豇豆在全国各地都有种植，因此形成了丰富的长豇豆地方品种。加之近年来长豇豆育种工作日见成效，进一步丰富了中国长豇豆遗传资源库，需要对这些资源进行遗传关系分析，为品种资源保存、利用、育种以及解决品种争议打下基础。结合我们的研究成果，本文介绍了分子标记在长豇豆遗传资源鉴定中的应用情况，并针对存在的问题，提出了几点看法。

1 用于长豇豆遗传分析的分子标记类型及其体系的建立

一般来说，蛋白质分子标记如各种同工酶的提取与电泳检测在各种植物中程序变化不大，因此，一般不需要建立和优化反应体系。由于不同植物基因组碱基组成不同，而以PCR为基础的众多分子标记都需要引物与基因组配对才能扩增，因此反应条件存在差异。需要针对不同植物种类和分子标记类型对反应条件进行优化才能获得最佳的扩增效果。

ISSR是由Zietkiewicz等[4]提出的用于扩增两个距离较近的相邻SSR位点间序列的一种方法。其原理是同一ISSR引物序列同时与两个距离较近但方向相反的SSR重复序列互补结合[5]，在模板、Taq酶和dNTP等存在的情况下扩增这两个SSR位点间的序列，因此ISSR变异来源于SSR位点多态性本身与SSR位点间的序列变异。在牛筋草和高粱的遗传分析中，ISSR技术被认为比RFLP更便宜，比RAPD重复性更高[5～6]。ISSR技术被认为更适合于遗传多样性较低的栽培品种内的遗传分析[7～8]，而通过RAPD等分子标记检测，豇豆种内多态性较低，作为豇豆的一种亚种，长豇豆内多态性应更低，因此，推测高多态性的ISSR分子标记技术应适合长豇豆亚种DNA多态性分析。彭海等[9]对长豇豆ISSR反应中模板、引物、dNTP和酶的浓度进行了初步筛选，通过正交设计试验确定了这4种关键成分的最终浓度，即引物为0.2 μM、模板为0.75 ng/μL、dNTP各200 μM/L和Taq聚合酶为0.5 U时，ISSR扩增效果最好。由于不同ISSR引物组成差异较大，除各种PCR反应成分要影响ISSR扩增带型外，引物退火温度也可显著影响结果的准确性。为此，彭海等[10]通过试验测定获得了长豇豆品种25条ISSR引物的最佳退火温度，发现不同引物间的差异较大，变异系数达到8.80%。与理论推测的退火温度比较发现，实测值与理论值间不具有明显的相关关系，相关系数仅为0.37。因此认为，可能试验实测是获得最佳退火温度的唯一途径。在长豇豆ISSR-PCR分析过程中，彭海等[11]发现，当模板浓度为0时（空白对照），ISSR反应同样可以扩增出条带。因此ISSR引物可以在所有生物中通用，由于空气中不可避免地存在微生物，因此，我们认为，污染应来源于空气中的微生物等。由于科学研究最基本的要求是现象能够重现，而污染问题已经严重影响到了这一原则。因此建议，在长豇豆ISSR与RAPD反应中都应该注意微生物污染的问题，整个反应体系所涉及的药品与器材应消毒，且整个操作应在超净工作台上严格进行，同时应在反应中设立阴性对照，阳性也应设重复，以监控污染是否产生。

微卫星或简单重复序列（SSR）是指1~6个核苷酸所组成的串联重复序列，SSR标记是一种以PCR为基础的分子标记技术[12～13]。因其变异频率高，其在遗传作图以及分析种间、亚种间、品种间甚至是品种内亲缘关系等方面都是一种理想的工具[14~16]。在禾本科植物如水稻[17]，以及豆类植物如大豆[18]、四季豆[19]中都已经开发出较多的SSR引物。但在豇豆中开发的微卫星引物较少，仅Li等[20]开发了65对微卫星引物，并证明其中27对引物能扩增出多态性带。之后这27对微卫星引物被多次应用于豇豆遗传多样性的研究中[21～22]。彭海等[23]对长豇豆SSR反应中模板、引物、dNTP和酶的浓度进行了正交设计分析，结果表明引物浓度对长豇豆SSR扩增影响明显，其他3种成分浓度没有显著影响，基因组差异亦对反应没有明显影响。通过进一步引物浓度试验并结合成本考虑，确定长豇豆SSR反应中成分的最佳浓度为：模板 1 ng/μL、引物 1.6 μmol/L、dNTP 100 μM/L、Taq聚合酶0.5 U。利用优化后的程序，彭海等[24]进一步对这27对已报道的SSR引物针对长豇豆进行了筛选，但仅有13对引物能对长豇豆基因组进行有效扩增。用这13对SSR引物对67份长豇豆品种进行分析表明：仅5对具有多态性（资料待发表）。以上资料表明，需要进一步针对长豇豆开发SSR引物数量，才能利用其分析长豇豆亚种遗传关系。

Vos等[25]于1995年公布了AFLP分子标记技术，该技术的大致原理与流程如下：利用两个限制性内切酶切割基因组，分别利用与酶切位点配对的接头与酶切片断连接，再利用与接头配对的引物进行预扩和选择性扩增。AFLP分子标记有两大特点。第一，与ISSR分子标记类似，可用于任何物种；第二，每一对引物组合扩增的位点数一般可达到50~100，扩增效率极高。因此，在其他分子标记都无法找到多态性时，一般AFLP可有效地获得多态性标记。豇豆栽培种中其他分子标记如RAPD所揭示的多态性不到20%[22，26]，远不及其他作物[27～28]，因此，AFLP分子标记在对长豇豆亚种遗传多样性分析中具有其特殊作用。然而，AFLP分析涉及酶切、连接、预扩、选扩和电泳等复杂程序，因此，容易产生假阳性，为了准确获得研究结果，有必要对AFLP反应程序进行优化。刘永华等[29]利用抗病与感病长豇豆为材料，建立并优化了长豇豆AFLP反应程序。除AFLP标准程序外，他认为高质量的基因组DNA是AFLP试验成功的关键因素。我们也认为，基因组DNA质量好坏，影响酶切是否彻底，能决定最终结果中假阳性的比率。我们试验了SDS，CTAB和试剂盒提取的长豇豆基因组DNA对酶切效果的影响，发现都存在酶切不完全的现象（资料未发表）。特别值得一提的是：虽然利用植物基因组试剂盒提取的DNA从分光光度计和电泳检测结果来看，质量都很好，但酶切效果依然较差。通过在标准提取程序中添加PVP和1%β-巯基乙醇，并且采用超纯水而不是TE溶解DNA，可以很大程度上解决酶切不充分的问题。由此可见，基因组DNA提取虽然已是经典的实验操作，但应用于高敏感性的AFLP反应程序中，依然存在较多需讨论之处。

2 分子标记在长豇豆遗传分析中的应用

直接以长豇豆为材料的研究不太多。胡志辉等[30]利用过氧化氢酶（CAT）和淀粉酶（AMY）的同功酶酶谱分析了21个长豇豆品种的多样性，获得的3个多样性位点可区分所供试的长豇豆品种。然而，Reis等[31]利用等位酶标记分析了豇豆遗传多样性，发现整个豇豆属内多态性都不高，且利用等位酶无法将长豇豆亚种与其他豇豆亚种区分开来。同样，Panella等[32]虽然认为等位酶可以很好地对豇豆种进行划分，但不能在栽培种之间进行区分。说明等位酶标记在豇豆特别是长豇豆遗传多样性分析中存在一定局限性。利用细胞保护酶标记和形态学标记，Chen等[33]进一步分析了23个长豇豆品种对盐胁迫的响应，利用系统聚类，将这23个品种分为耐盐和不耐盐两个明显类群，显示了细胞保护酶标记等在耐盐长豇豆资源鉴定中的作用。利用Li等[20]开发的SSR引物，Phansak等[34]对全球范围内15个长豇豆品种在16个SSR标记位点上的多态性进行了分析，发现在相似系数为0.67处，可将这些长豇豆分为3个类群，然而，它们似乎与长豇豆的地理起源并无关系。该研究中，中国起源的长豇豆品种仅3个，由于品种数少，在全基因组范围内检测的位点数也仅有16个，可能造成结果可靠性变差，且对长豇豆品种，特别是中国长豇豆品种的代表性较差。Sarutayophat等[35]利用5个RAPD引物分析了37份长豇豆品种遗传关系，发现这些RAPD引物能相对较好地将长豇豆和豇豆分成不同的类群。最近，陈禅友等[36]利用23个有效RAPD分子标记分析了40个长豇豆品种遗传多样性，根据长豇豆品种DNA分子RAPD系统树图，可将长豇豆品种分为5个品种群，从而弥补根据形态性状异同来判别品种的不足，研究揭示了由于自然和人工选择可遗传性状变异积累、地理隔离歧化和人工杂交强化基因重组等共同作用而形成的品种基因组差异的现实。

其他研究部分涉及长豇豆亚种。Chen等[37]利用种子贮藏蛋白分析了中国栽培豇豆属及近缘属遗传变异，分析涉及早翠等7个长豇豆品种代表。研究发现：长豇豆亚种内品种间差异很小，所用的7个品种仅显示出3种带型，且彼此相似。相反，大豆品种间和饭豆品种间呈现出遗传多态性。两个豌豆品种表现出种内相似的种子蛋白质带型，但能够彼此区分。该研究与前人利用RAPD等[22，26]分子标记对长豇豆遗传多样性分析的结果相类似，即多态性都不高。与Chen等[37]研究相对应，Fana Sylla等[38]利用RAPD分子标记技术研究了豇豆栽培种、野生种及其近缘种间的亲缘关系。但长豇豆亚种内仅2个品种，分别来自苏格兰和菲律宾。在扩增获得的202个RAPD条带中，发现了3个条带仅长豇豆亚种中含有，显示了它们在区分长豇豆亚种与其他豇豆亚种中的潜在作用。另一项类似研究的材料涉及意大利的豇豆地方品种和一个长豇豆选育品种[39]。虽然长豇豆材料所占比重很小，但74.6%的RAPD多态性带型都由长豇豆所特有，其中24个RAPD引物可将意大利育成的长豇豆品种与其他豇豆地方品种区分开[39]，显示了长豇豆与其他豇豆品种在分子标记上存在巨大差异，或者，这些RAPD引物可能与育种者所关心的一些关键性状如产量、抗性等紧密连锁。

除RAPD外，其他分子标记也被广泛用于长豇豆资源分析中。Archana等[40]利用SSR分子标记分析了豇豆属遗传多样性，其中包含一个来源于中国的长豇豆品种。结果表明：长豇豆亚种在聚类图上比豇豆的另一原始栽培亚种textilis更接近普通豇豆亚种。Fatokun等[41]在利用RFLP标记分析豇豆亲缘关系时也得到了类似结论：长豇豆亚种在聚类图上与其他栽培种和野生亚种dekindtiana关系密切。这些结论都与长豇豆的起源与传播过程相一致。但另一些研究结论与此存在一定差异。Gillaspie等[42]利用AFLP和SSR分子标记分析了豇豆不同亚种间的遗传关系，其中涉及3个长豇豆品种。虽然AFLP和SSR标记的多态性都较高，但聚类结果却显示豇豆野生亚种dekindtiana被混入了长豇豆栽培亚种之中。此现象与形态学观察相差甚远，因为长豇豆属于栽培种，与野生亚种dekindtiana差别相当明显，如种子更大等。同样，26个有效的DAF标记并不能将长豇豆亚种与短豇豆亚种区分开来[43]。以上结果提示我们：在豇豆或长豇豆亚种内遗传多样性分析中，应结合形态学结果，仔细分析分子标记的结果，否则容易出现明显的偏颇。值得一提的是，Tosti等[39]比较了RAPD、AFLP和SAMPL标记在分析豇豆地方品种（含长豇豆）亲缘关系中的利用价值，发现SAMPL标记所需要的引物数最少，且与表型相关性最为显著，显示SAMPL标记在豇豆亲缘关系分析中具有独特优势。

3 问题与展望

3.1 针对长豇豆的SSR分子标记过少

虽然各种分子标记都可应用于长豇豆遗传关系分析，然而各种分子标记在豇豆资源鉴定中各有其自身优势与不足。RAPD标记检测的位点多，引物通用，但普遍认为不够稳定，而且在豇豆中RAPD标记不能反应亲缘关系，被认为不适合做豇豆亲缘关系分析[22]。AFLP与SAMPL标记的多态性很高，能够有效区分普通豇豆不同品种[26]，然而酶切、扩增与PAGE检测程序复杂，费用高，在基础研究中应用较多而在品种纯度或资源鉴定等研究中应用较少。ISSR标记虽然不需要复杂的检测程序且具有较高的多态性，然而与AFLP、RAPD一样，属于非共显性标记，此特点决定其很难用于检测杂合基因型。SSR标记引物序列特异，多态性高且为共显性，在资源与种子纯度鉴定等方面应用最为广泛，然而目前在整个豇豆属中有差异的有效SSR标记仅20多个[20]，由于长豇豆亚种内品种间亲缘关系更近，因而有效SSR标记更少，根据我们研究结果，仅有13对SSR引物能对长豇豆基因组进行有效扩增[24]，其中仅5对具有多态性（资料待发表），还远不能满足实际应用的需要，需要开发更多的长豇豆SSR引物。

3.2 长豇豆分子标记多态性偏低与形态性状多态性高的矛盾

虽然多项分子标记如等位酶[31]和DNA标记[22,26]的研究结果都揭示豇豆或长豇豆亚种内遗传多样性较低，然而它们在荚色、荚长和荚质量等形态学性状上存在较大的差异[35,44]，这种现象一方面提示我们在运用分子标记研究长豇豆遗传多样性时，应结合形态学的结果进行解释，另一方面也促使我们去思考：为什么分子标记所揭示的遗传多样性并没有在表型中表现出来？是因为我们大量检测的变异位点属于中性变异，与自然选择或性状表现无关吗？从最近的一项研究来看，这种推测是具有一定依据的。Li Wang等[45]利用基因起源的分子标记研究了美国农业部收集的豇豆资源亲缘关系，发现承受了较小自然选择压力的内含子比外显子更能揭示遗传多样性。最近，我们研究了长豇豆亚种内不同品种间DNA甲基化修饰多态性差异。结果发现，不同品种间除在DNA序列上存在明显不同外，在甲基化修饰上也存在明显的差异（结果待发表）。虽然DNA甲基化不能通过传统的DNA分子标记技术检测到，但DNA甲基化却广泛参与了植物生长发育和性状的表现，因此，以DNA甲基化修饰为代表的表观遗传学可能是遗传标记与形态学差异的原因之一。

3.3 需要将分子标记与形态学研究相结合

虽然包括陈禅友等[46]在内的众多研究都在形态学水平上分析了长豇豆亚种遗传多样性，同时，各种分子标记也被多次应用于长豇豆遗传资源鉴定，然而，这二者相结合的研究却相对较少。只有当分子标记所提示的DNA多态性信息与生物学功能相结合才能指导种质资源保存与育种实践，因此，长豇豆分子标记与形态学研究相结合应在以后研究中得到加强。

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