Nkx2-5转录因子在心脏发育中的作用

杨 哲综述,张 勇审校

（济南军区总医院心外科 250000）

心脏是脊椎动物在胚胎发育过程中第一个形成的器官,脊椎动物的心脏由多细胞系的特化到管状结构的形成,最后精确组装为成熟的4个心腔结构,经历了一个复杂的发育过程,它涉及到多种基因不同时间和不同空间的先后表达与相互作用。研究脊椎动物心肌基因表达的分子调控是了解调节心肌发生的关键。Nkx2-5是目前研究较多的与心脏发育密切相关的转录因子。

1 Nkx2-5转录因子

最初人们应用果蝇同源结构域（homeodomain,HD）寡核苷酸探针筛查果蝇cDNA文库,克隆出NK型同源盒基因,随后分离出一种与果蝇背侧血管/心脏发育密切相关的果蝇NK-2型基因——tinman基因。当tinman基因发生突变时会导致果蝇心脏形成异常。由于该类基因在进化中的高度保守性,人们猜测是否在脊椎动物体内也存在着这一类基因并且保留着相似的功能。目前已从脊椎动物鉴定出6个结构和功能上与tinman基因相关的基因,即Nkx2-3、Nkx2-5、Nkx2-6、Nkx2-7、Nkx2-8、Nkx2-9。其中Nkx2-5/Csx（cardiac specific homebox）基因正是影响心脏发育的关键性的转录因子之一[1]。1993年研究人员应用cDNA文库筛查、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、RT-PCR和原位杂交等分子技术分别在两栖类和啮齿类动物体内分离出Nkx2-5基因,并证明其确实与果蝇tinman基因高度同源[2]。Lyons等[3]报道被破坏Nkx2-5基因的小鼠心脏发育异常。Turbay等[4]在成人心脏cDNA文库中分离出Nkx2-5基因,进一步将其定位于5q35。Schott等[5]证实在人类先天性心脏病患者中确实存在 Nkx2-5基因的突变。

NK-2编码转录激活因子是DNA结合蛋白质,结合位点位于目的基因的启动子和（或）增强子的共有序列（T[C/T]AAGTG）,它能激活转录。它的同源结构域（60个氨基酸）的三维结构是由3个α-螺旋组成,其中螺旋Ⅱ和Ⅲ形成一个螺旋-转角-螺旋的结构,NK-2同源结构域的C-末端包含17个氨基酸的保守序列,NK-2特异结构域有一个不变的疏水氨基酸中心簇（VPVLV）,它可能在蛋白质与蛋白质的相互影响中起作用,如果这个结构域发生突变,将会影响它在体外结合DNA的能力。Nkx2-5是NK型同源盒基因家族Nkx2型成员,是心脏前体细胞分化的最早期标志之一。它主要通过同源盒结构域与目的基因中相应的顺式作用元件（NKE）序列（5′-TNAAGTG-3′）结合,作为转录因子启动下游基因的转录,在胚胎发育和器官形成中发挥重要作用。Nkx2-5位于人类染色体5q35,具有两个外显子。该基因的侧翼序列及外显子之间存在着许多具有重要功能的启动子、增强子、抑制因子和一些自动调节因子。它们在不同时间和空间调控Nkx2-5基因,使其在心脏及其他器官的发育过程中发挥复杂的调节作用。Nkx2-5基因编码的蛋白具有4类高度保守的结构域,其中包括N端的TN（tin）结构域、160个氨基酸组成的同源盒结构域（HD）、位于HD下游的NK2-SD和C端含有GI-RAW保守的结构域。其中HD可以与目的基因中相应的启动子结合,从而促进下游基因的转录。对这种蛋白质-DNA结合的最有意义的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸等,除此之外Nkx2-5还有一个富含丙氨酸和脯氨酸残基的阻遏结构域,以及富含上述两种氨基酸和天冬氨酸、谷氨酸残基的激活域。它们的变化将引起蛋白质-DNA间亲合力的改变,从而影响基因的转录,产生相关蛋白的缺陷,形成心脏畸形[6]。

Nkx2-5基因具有明显的心脏特异性表达的特点,虽然在发育阶段的脾、舌、胃和甲状腺等组织中Nkx2-5基因也有低度表达,但出生后除心脏外其他器官中Nkx2-5蛋白水平都明显下降。这说明Nkx2-5在mRNA和蛋白水平上对多种器官的发育都有一定的影响,尤其对心脏发育的作用最为明显[7]。

Nkx2-5是背侧中胚层形成所必需的,它在心肌开始分化前即开始表达,是所有脊椎动物心脏发生中最早表达的转录因子,即心脏前体细胞最早的标志物。在心脏发育过程中，Nkx2-5最初见于心脏头褶期心肌源性前体细胞,持续表达于心肌细胞分化阶段,随后在胚胎、胎儿和成体心肌细胞中保持一定的表达水平。应用 RNA原位标记技术显示在怀孕后7.5d时Nkx2-5开始表达,主要在心肌发生板的内胚层和中胚层的细胞核中表达[8]。到了成熟阶段,Nkx2-5/Csx只在房室肌细胞核中表达。Nkx2-5/Csx基因突变的纯合子小鼠胚胎可形成心脏,但不能正常旋转,且心壁变薄、心功能不全、心脏不完全分隔、不表达心室特异性基因等,胚胎很快死于循环衰竭[7]。

随着对Nkx2-5基因结构和表达情况的阐明,更多的研究转向Nkx2-5基因的功能及调节作用机制。大量研究表明，Nkx2-5基因敲除导致胚胎死于心脏畸形,Nkx2-5基因的过度表达也可以引起心脏增大。有资料显示,Nkx2-5基因位于许多对心脏发育有作用的基因的上游,在Nkx2-5-/-小鼠应用原位杂交技术检测相关基因,发现anf、mlc2v、mef2c、mhc等基因的表达受到严重干扰[9]。同时,Nkx2-5基因也受到多种因素的调节。脊椎动物与果蝇dpp基因相关的基因骨形成蛋白（bone morphogenesis proteins,BM Ps）在胚胎中胚层的形成早期发挥作用,小鼠bmp2缺失,Nkx2-5不表达,心脏早期发育阶段停滞[10]。有研究表明,GATA-4和Nkx2-5之间存在相互协调作用,并具有启动子依赖性,而且复杂的顺式调节作用在心肌细胞的基因表达中有重要地位。体外实验表明,Nkx2-5基因的表达可以启动心肌的发生,并且在心肌分化过程中激活mef2c基因；而mef2c基因的表达在启动心肌发生的同时可以上调Nkx2-5、GATA4、α-肌动蛋白和M HC的表达[11]。

2 Nkx2-5与其他转录因子之间的相互作用

有研究表明,GATA-4与Nkx2-5能相互作用,彼此是辅助因子。在心肌细胞中两者相互作用调节心房利钠因子和α-心肌肌动蛋白启动子的表达。通过转基因分析显示,ANF启动子有1个Nkx2-5的结合位点,2个GATA-4结合位点,这些结合位点对于ANF的表达是必须的[12]。有研究表明,Nkx2-5和GATA-4转录因子可以通过协同作用使内源性α-心肌肌动蛋白 mRNA表达增高 100倍[13]。它们的交互作用是通过Nkx2-5的同源区域的螺旋Ⅲ和GATA-4的C-终端锌指区域之间的相互作用实现的。在异源细胞中共同表达GATA-4和Nkx2-5导致协同激动ANF的启动子。这个协同作用包括在离体和在体上的GATA-4和Nkx2-5相互作用。结构/功能分析说明GATA-4结合到Nkx2-5可以导致Nkx2-5激动区域的结构改变,这种作用可以在早期心肌形成关键路径中提供协同的交叉作用[14]。

GATA-4因子也能调节Nkx2-5在心肌发育时的表达,提示在心肌中Nkx2-5和GATA转录因子之间存在一个相互增强的转录调节循环通路。在早期心脏形成中,GATA-4在心脏谱系与Nkx2-5共表达,GATA-4和Nkx2-5互相依赖共同发挥作用,在Nkx2-5的远端增强子含有限制性心脏锌指转录因子GA TA-4的高亲和性结合位点,Nkx2-5的心脏特异性上游增强子在线性心管和环化的过程中处于活化状态[15]。

综上所述,组织特异性Nkx2-5同源核蛋白是心肌细胞前体最早的标记,是心脏形成的关键,但不能发起心脏的形成。它在心脏发育过程中与其他的转录因子起着互相协同的作用,一起调节心肌特异基因的表达。过度表达Nkx2-5可以促进前体心肌细胞的发育。

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