分子标记技术在牧草种质资源研究中的应用

李志勇,孙启忠,李鸿雁,王小丽,2,师文贵,戴 军

(1.中国农业科学院草原研究所,农业部沙尔沁牧草资源重点野外科学观测试验站,内蒙古呼和浩特 010010;2.甘肃农业大学草业学院,草业生态系统教育部重点实验室,中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃兰州 730070;3.内蒙古乌兰察布市察右中旗扶贫办公室,内蒙古乌兰察布 013461)

牧草种质资源是指所有牧草物种及其可遗传物质的总和。他是牧草及农作物改良所用的原始材料,是农业自然资源的重要组成部分,在草地畜牧业生产中发挥着巨大不可忽视的作用[1]。我国的草地面积约4亿hm2,占我国陆地总面积的41.7%,是农田面积的近4倍[2]。我国是世界上牧草种质资源最丰富的国家之一,蕴藏着丰富的遗传基因,为了充分开拓利用丰富多样的优异种质资源,就必须把不同的个体加以区别。目前,最可靠的方法是分子标记[3,4]。分子标记是以生物大分子的多态性为基础的遗传标记,其直接反映水平上的个体差异。他的产生突破了遗传学研究的瓶颈,克服了传统的形态标记、细胞学标记和生化标记易受外界因素、生物个体发育阶段及器官组织差异影响的缺陷,具有不可比拟的优势,因而具有广泛的应用前景[5]。

1 分子标记的类型和特点

1.1 RFLP分子标记

常见的分子标记技术主要有 RFLP、RAPD、AFLP 、SSR、ISSR等。

RFLP标记(限制片段长度多态,RFLP)作为遗传工具由Grozdicker在1974年创立,是最早发展的分子标记。基本原理是:不同材料的DNA用已知的限制性内切酶消化后,产生许多大小不等的DNA片段,经电泳分离、Southern印迹转移到硝酸纤维膜上,用放射性标记的探针与膜上变性的酶切DNA进行杂交,放射自显影,显示出不同材料的多态性图谱,即显示出所分析的DNA序列间的 RFLP。RFLP标记呈孟德尔式遗传,大多数RFLP的等位基因为共显性;广泛存在于生物体内;在任何分离群体中可区分纯合基因型与杂合基因型;在非等位的RFLP标记之间不存在上位互作效应;结果稳定重复性好,标记的数目多且稳定[6]。这些优点使RFLP标记适用于构建高密度的遗传图谱,基因标记定位,分析群体内和群体间遗传变异度、群体间基因流评价和亲缘关系等方面。尽管该技术有上述诸多优点,但也有其局限性:对DNA的量及纯度要求高;实验操作复杂,成本高,效率低,而且探针具有种属特异性;大多数RFLP多态位点信息量低,其多态性过分依赖限制性内切酶的选用[7]。

1.2 RAPD分子标记

RAPD(随机扩增多态DNA)是1990年由美国杜邦公司的Williams和加里福尼亚生物研究所的Welsh同时发展起来的一种分子遗传标记技术,是建立在PCR基础上的一种DNA分子标记技术[8]。RAPD技术就是以人工合成的随机核苷酸序列为引物(通常为9～10个 bp),以基因组总DNA为模板,利用PCR技术随机扩增得到一系列的多态性DNA片段,然后电泳检测其多态性。RAPD技术的优点是:不需要DNA探针;使用随机引物,合成引物时无需预知被研究材料的基因组序列,一套引物可用于不同植物的研究;RAPD技术操作简便、快速,可免去RFLP中的克隆制备、同位素标记、Southern杂交等步骤;RAPD分析所需DNA量少,每个反应仅需几十纳克的DNA;不受环境、发育、数量性状遗传等的影响。因此,RAPD技术适用于种质资源的鉴定和分类、目标性状基因分子标记、遗传图谱的快速构建等研究,在植物种质资源研究利用上得到了广泛应用[9]。但RAPD也存在着一些实际困难:RAPD检测的多数位点标记带为显性特点,不能提供完整的遗传信息;用于二倍体生物时,区别纯合子和杂合子会有难度;RAPD的再现性(稳定性,重复性)差;存在共迁移问题。

1.3 AFLP分子标记

AFLP(扩增片段长度多态)是由Zabeau 1992年发明的一项新的DNA分子标记技术,该标记技术的出现是DNA指纹技术的重大突破。AFLP是在PCR和RFLP的基础上发展起来的一种检测DNA多态性的新方法,其结合了RFLP和RAPD技术的优点,并于1993年获得欧洲专利局专利[10]。其基本原理是通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测DNA酶切片段长度的多态性。先用限制性内切酶消化切割染色体DNA,产生大量不同大小的DNA片段,然后采用PCR技术将这些片段扩增。由于不同材料的DNA酶切片段存在差异,因而就产生了扩增产物的多态性。

近年来AFLP技术在品种指纹图谱的绘制,遗传连锁图的构建及遗传多样性的研究得到了广泛的应用[11]。AFLP技术也存在一些缺点:不是全共显性标记,条带统计分析难度较大;对DNA的纯度和内切酶的质量要求较高,技术要求高;AFLP技术试剂盒昂贵,成本较高相对费时[12,13];扩增时有假阳性结果和假阴性结果出现,凝胶背景杂乱。

1.4 SSR分子标记

在真核生物基因组中,散在分布着由1-6bp组成的简单重复序列,即简单序列重复(simple sequence repeat,SSR),又称为微卫星 DNA(micro-sateuite DNA)。不同品种或个体核心序列的重复次数不同,但重复序列两侧的DNA序列是保守的,利用与核心序列互补的引物,通过PCR扩增和电泳可分析不同基因型个体在每个SSR位点上的多态性,即为SSR技术[14]。

SSR技术的优点是(1)检测的多态性频率高、重复性好、共显性、在基因组中随机分布,标记数量多;(2)实验重复性好,结果可靠性高,操作简单;(3)该标记所需DNA量少,仅需微量组织,即便其降解,亦能有效地分析鉴定。在基因组研究中作为一种主要的分子标记技术,已广泛应用于遗传图谱的构建、比较基因组研究、遗传多样性分析和系统学研究。但是,SSR需要测序和设计引物,因而需要大量的人力、物力和时间,另外,其种属特异性强,开发所需的费用高昂[15]。

1.5 ISSR分子标记

ISSR(简单重复序列间区,ISSR)是以重复序列的单一引物为主要引物序列的PCR标记,由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等1994年提出。优点是遗传多态性高、重复性好、显性标记、耗资少、模板用量少等[16,17]。不足之处在于PCR扩增反应的最适条件需要一定时间摸索;ISSR标记大多是显性标记,在解决交配系统计算杂合度与父系分析等问题时效果不佳。

2 在牧草种质资源研究中的应用

2.1 遗传连锁图谱的构建和基因定位

遗传连锁图谱(genetic linkage map)指通过遗传重组分析得到的基因或专一的多态性遗传标记在染色体上线性排列顺序图,其间的距离通常用遗传重组值来表示。遗传图谱是植物遗传研究的重要内容,又是种质资源、育种及基因克隆等许多应用研究的理论依据和基础。遗传连锁图谱的构建步骤包括:(1)依据研究对象、目标和现有条件选择所用遗传标记;(2)确定亲本组合,构建作图群体;(3)分析构图群体中植株的标记基因型;(4)标记间连锁群和标记位点的确定[18]。分子标记是构建高饱和度连锁图的有力工具,利用分子标记能进行图谱基因克隆生产转基因植物;在遗传图谱的基础上进行数量性状基因的定位(QTL)、标记(t-agging)、为分子辅助选择(molecular-assisted/aided selection,MAS)提供高效的标记;遗传连锁图谱的构建为利用分子标记技术进行基因定位奠定了坚实的基础,而进一步的比较基因组图谱在植物基因组学和进化研究中具有重要的作用[19]。

国内外科学家现已定位了水稻、大豆、小麦、玉米等作物的基因,牧草和草坪草的基因定位研究相对较少。目前,已构建了20多张牧草和草坪草遗传连锁图[20],主要有紫花苜蓿(Medicago sativa)、黑麦草(Lolium spp.)、羊茅(Festuca spp.)、结缕草(Zopsia spp.)和百脉根(Lotus spp.)、三叶草(Tri folium repens)等常用草种。百喜草(Paspalum spp.)、赖草(Leymus spp.)、高丹草(Sorg-hum ×Sudan grass)等也有研究报道。

Xu等基于RFLP分子标记构建了世界上第一张六倍体高羊茅(Festuea arundinacea)的遗传图谱[21]。Brummer等采用RFLP标记构建了紫花苜蓿(Medicago sativa)108个标记数的遗传连锁图谱[22]。Barcaccia等应用AFLP,RAPD和RFLP对紫花苜蓿进行遗传连锁分析,构建了67个标记的图谱[23]。Mccoy等在抗寒抗病性强的同源四倍体苜蓿(Mdzhawakhetica)中发现了70个RAPD标记和l5个RFLP标记[24]。Albertini等利用AFLP与RAPD技术构建了包括55个位点的完整的紫花苜蓿基因连锁图谱,并发现了1个与紫花苜蓿未减半配子产生有关的特别的AFLP标记[25]。Julier等利用7对引物,获得了 186个显性AFLP标记,绘制了四倍体紫花苜蓿亲本及杂交后代遗传图谱[26]。Isobe等构建了三叶草的第一张基于cDNA探针的RFLP遗传图谱[27]。逮晓萍等以高丹草(Sorghum ×Sudan grass)(314A ×ZKSD)的 F2∶3家系作为构图群体,构建了包含158个AFLP、8个RAPD标记的高丹草AFLP和RAPD遗传连锁图,覆盖高丹草基因组 836cM,标记间平均间距为 5.03 cM[28]。丁成龙等采用 SSR、AFLP、EST-CAPS和RGA-CAPS等标记方法利用对多花黑麦草细胞质雄性不育(CMS)F1群体进行了遗传连锁图的构建[29]。Bouton等定位了苜蓿耐铝数量性状位点(QTL)[30]。Sledge等用2种 RFLPs标记对双倍体苜蓿进行RFLP分析,结果发现有2个与耐受有毒的酸性铝相关的基因,并将其定位在苜蓿RFLP图谱上[31]。在苜蓿染色体上有4个位点与耐铝有关,其中一个位点起主效作用[30-32]。Petrusa等在苜蓿cDNA文库中分离出PUM90-1,PUM90-2和PUM91-4三个脱落酸诱导基因,这3个基因都与盐胁迫有关[33]。遗传图谱的绘制使牧草遗传研究取得了重大进展,并对未来的分子标记育种将产生巨大的推动作用。

2.2 遗传多样性与亲缘关系分析

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分,遗传多样性水平的度量和保护已成为生物多样性研究的核心问题。分子标记是统计遗传多样性水平的有效工具,可以确定亲本之间的遗传差异和亲缘关系,从而确定亲本间的遗传距离并进而划分杂交优势,提高杂种优势潜力,利用DNA多样性可以计算种群间的遗传距离[34]。

近年来,利用分子标记技术从DNA水平上对牧草各品种间的亲缘关系、起源及进化等进行了研究探讨,取得了较大进展。盛红梅等[35]应用RAPD技术对甘肃省内的23种忍冬属植物的遗传多样性及其种间关系进行了探讨,表明其具有较为丰富的遗传多样性。田志宏等[36]采用RAPD技术对从美国引进的12份草地早熟禾品种进行了遗传多样性分析,结果表明RAPD技术能够有效地检测出草地早熟禾品种间的遗传变异,具有较高的遗传多样性。张吉宇等[37]利用RAPD标记分析胡枝子属14个野生居群遗传多样性,揭示了居群间存在较高的遗传多样性。孙建萍等[38]利用微卫星分子标记对我国16份披碱草进行遗传多样性研究,结果表明披碱草的遗传多样性主要存在于居群内。。魏臻武等从60多对SSR引物中筛选出8对有效引物,并检测出苜蓿不同基因组相当丰富的遗传多样性[39,40]。在对多年生黑麦草(Loliumperenne)的研究中,Jones等也检测到了SSR标记高达67%的多态性[41]。

Ferdinandez等用 RAPD标记鉴定无芒雀麦草(Bromus inermis Leyss)和草地雀麦草及其杂交雀麦草间的亲缘关系,结果表明,杂交雀麦草与无芒雀麦草间遗传变异小,与草地雀麦草间遗传变异大,而亲本间遗传变异最大。Weaver等人通过DNA扩增指纹,用任意的核苷酸序列作为引物鉴定假俭草(Eremochloa ophiuroides)的遗传多样性及其变异情况,以便找到该品种的原始种。Huf等用草地早熟禾(Poap L.)为研究材料,通过改进银染聚丙烯酰胺凝胶的方法,利用RAPD标记确定了源于兼性无融合生殖变异株的遗传起源[42]。

2.3 品种鉴定与纯度分析

牧草和草坪草品种大多是由野生种驯化而来,或是遗传背景相近品种的杂交组合,而鉴定品种纯度的常规方法是根据田间表型性状进行鉴定,随着登记品种的增多,利用形态标记这一传统方法来区分品种已变得十分困难,生化标记方法鉴定品种真实性和纯度时受组织或器官特异性差异影响,且成本比较高;利用DNA指纹分析技术对牧草品种进行分析鉴定,不仅不受牧草生长环境、发育阶段和组织的影响,而且能够简便、快速、省时和准确地鉴定不同的品种、品系及其相互之间的亲缘关系[43,44]。

刘公社等利用SSR标记对黑麦草属和羊茅属的品种进行鉴定,证明[AC(GACA)4]能有效地区分黑麦草和羊茅[45]。Akagi等用17个SSR标记有效地区分了59个亲缘关系密切的日本粳稻品种[46]。郑玉红等对采自中国不同地区的6份狗牙根(Cynodon dactylon)优良选系进行了RAPD分子标记实验的结果表明,RAPD分子标记可成功地用于中国狗牙根优良选系遗传多样性的研究及品种鉴定[47]。钟小仙等利用RAPD技术对美洲狼尾草不育系23A、23DA、恢复系3B-6及其相应的3个Fl杂交种基因组进行多态性分析,其中条带清晰且重复性好的引物S369,为美洲狼尾草亲本材料及其杂交种鉴定和纯度分析提供了一种快速、准确的检测手段[48]。傅小霞等利用RAPD标记鉴定技术柱花草种子,首次为柱花草种子的品种鉴定提供了完整的分子标记检测方法[49]。毛培胜等采用分子标记方法进行紫花苜蓿品种鉴定的结果表明:RAPD分子标记引物的筛选、标记程序的完善,确定品种特异性标记谱带,可以用于进行紫花苜蓿品种的鉴定[50]。

2.4 加速和优化育种进程

传统的牧草育种方法是通过其表现型进行选择,具有很大局限性。而分子标记辅助选择是在DNA水平上进行的优化选择,克服了传统育种的盲目性,具有不受环境条件和植物生长发育阶段影响的优点,且检测直接快速方便,可靠性强,并对牧草优良的物理性状、生理生化特性的连锁基因进行标记、定位,并通过克隆测序将标记基因制作探针,直接用于杂种早期选择、抗性鉴定等方面。尽管从表面看分子标记辅助育种比传统的形态选择成本高,但是,成本/利益却不高,特别是在处理复杂的性状上展现了极有潜力的用处[51]。

国内分子标记技术应用于牧草育种研究仅处于起步阶段。抗逆性育种方面,杨青川等以中苜一号和耐盐苜蓿大西洋为材料,应用RAPD技术,对14组280条随机引物进行了筛选,为耐盐苜蓿的耐盐基因分子遗传标记的研究奠定了基础[52]。抗病育种方面,桂枝等运用RAPD技术,采用集群分离分析法对5个苜蓿品种进行了抗褐斑病基因连锁的分子标记研究,筛选出8个能够同时在3个以上苜蓿品种内的抗、感材料间显示多态性的随机引物[53]。

3 发展前景

分子标记已在牧草种质资源遗传连锁图谱的构建和基因定位、遗传多样性与亲缘关系分析、品种鉴定与纯度分析以及加速和优化育种进程等领域发挥了重要作用。我国分子标记技术应用在牧草种质资源的研究方面起步较晚,无论在研究内容上还是在研究方法上相对较少,因此,需要加大研究力度,投入更多的人力和财力,借鉴国外的研究成果,结合国内的实际情况,把研究重点放在主要特色牧草资源上。分子生物学技术在不断完善和进步,成本在不断降低,其必将给牧草种质资源的各方面研究带来新的革命。

目前,分子标记主要应用于牧草的基础研究工作,预见在不久的将来,分子标记技术在牧草种质资源以下几个方面研究中将会产生深远的影响:(1)开发利用丰富野生牧草种质资源优异基因方面,利用分子标记技术挖掘和鉴定与高产、优质、高抗相关的基因,进行精确定位、分离克隆及遗传转化。(2)在牧草大面积生产中,标记控制适宜当地气候条件的重要基因,提高牧草的产量、品质和生态效益。(3)在利用分子标记辅助育种选择方面,通过分子标记技术对牧草抗病、抗虫、耐淹、抗旱、抗寒、耐盐碱等抗逆性基因进行精确定位,结合转基因技术,将有利于培育出优质高抗的新品种。

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