三种致病菌粗脂多糖（LPS）对团头鲂的免疫原性

胡火庚 汪成竹 陈昌福

三种致病菌粗脂多糖（LPS）对团头鲂的免疫原性

胡火庚 汪成竹 陈昌福

胡火庚，江西省水产技术推广站，高级工程师，330046，江西 南昌。

汪成竹，河南省信阳农业高等专科学校。

陈昌福，华中农业大学水产学院。

★ 农业公益性行业科研专项经费项目（200803013）和973项目（2009CB118700）资助

国内外大量研究表明，从革兰氏阴性菌中提取的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）对养殖鱼类具有比较强的免疫原性和良好的免疫保护作用。Kawai等（1987）采用温酚法从鳗弧菌（Vibrio anguillarum）中提取的菌体LPS接种香鱼（Plecoglossus altiveliss）后能使受免鱼得到良好的免疫保护力。Salati等（1984）的研究证实，从迟缓爱德华菌（Edwardsilla tarda）中提取的菌体LPS对日本鳗鲡（Anguilla japonica）具有良好的免疫原性。陈昌福等（1997）先后利用从鱼类多种致病菌中提取的粗LPS分别免疫接种鲤（Cyprinus carpio）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus） 和鳜（Siniperca chuatsi）等养殖鱼类，均获得了比较好的免疫效果。黄辨非等（2002）采用温酚法从鳗弧菌（V.anguillarum）、哈维弧菌（V.harveyi）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）的菌体中提取的粗LPS分别接种异育银鲫（Carassius auratus gibelio）后，比较了3种致病弧菌菌体粗LPS对异育银鲫的免疫原性的差别。

随着网箱饲养团头鲂（Megalobrama amblycephala）的迅速发展，各种传染性疾病的发生越来越频繁，依靠药物有效控制团头鲂各种传染性疾病的难度也越来越大。本研究利用从患病团头鲂体内分离的柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和温和气单胞菌（Aeromonas sobria），分别提取其菌体LPS后，对网箱饲养的团头鲂进行了免疫接种试验，旨在为研制预防团头鲂的鱼用疫苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株及其培养

用于本研究的柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌和温和气单胞菌由江西省南昌县某水产养殖场饲养的患病团头鲂体内分离得到。将保存的菌种先在脑心浸液培养基（BHI，Difco产品）中 25℃条件下，预培养 24 h，再转接种于淡水琼脂培养基（FWA）中，培养48 h后，离心集菌并以灭菌生理盐水清洗3次，稀释菌液至一定的浓度，加入终浓度为0.5%的福尔马林，冷藏备用。

1.1.2 菌体粗LPS的提取

参照Westphal等（1965）的方法分别从柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌和温和气单胞菌3种供试菌中提取粗 LPS（分别简称为 fc-LPS、ah-LPS 和 as-LPS）。

1.1.3 供试鱼

供试鱼饲养于武汉市洪山区汤逊湖的网箱中，网箱规格为3.0m×3.0m×2.0m。每个网箱内放养500尾，平均体重为324.0 g。

1.2 方法

1.2.1 试验鱼分组与饲养管理

从环境条件大致相同、同一个鱼排的30个相同规格网箱中随机选取4个网箱（分别作为Ⅰ～Ⅳ组）用于本试验。在开始试验前，利用过筛法从全鱼排网箱饲养的团头鲂中选择规格相近的鱼体放于拟做试验的4个网箱中。每天投喂相当于鱼体重3.0%的饲料，早、晚各1次。所用饲料为武汉海大饲料公司生产的团头鲂专用饲料。试验期间温度变化于18.5～27.5℃之间。

1.2.2 免疫接种

用灭菌生理盐水分别将3种菌体粗LPS调整至5.0mg/ml的浓度后，按25.0mg/kg鱼体重的接种量，以注射法经供试鱼的胸鳍基部接种，每1种菌体LPS溶液各注射500尾供试鱼放入同一个网箱，分别作为3个试验组。另外以注射大致相同剂量生理盐水的500尾团头鲂，放入另一个网箱内作为对照组。

1.2.3 采血

分别于免疫接种后第7、14、21和28 d，从每个试验组和对照组网箱中分别随机抽取15尾鱼采血。将每尾鱼的血液均分为2份，1份置常温下凝血后分离血清，供检测凝集抗体效价和交叉凝集抗体效价用；另1份以肝素抗凝，供分离白细胞测定其吞噬活性之用。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 凝集抗体效价的测定

采用血凝板依常法进行。反应抗原分别采用经福尔马林灭活的F.columnare（简称F-FC）、A.hydrophila（简称 F-AH）和 A.sobria（简称 F-AS）。

1.3.2 吞噬活性的测定

对采血后的供试鱼立即解剖，取出头肾，在L-15培养基（Difco产品）中用灭菌剪刀将头肾剪碎，再用白金网过滤，去除组织块。以600 r/min离心10min，将滤液中的细胞清洗3次后，离心回收细胞并用L-15培养基将细胞浓度调整至1.0×105个细胞/ml，作为头肾吞噬细胞液；将抗凝血以600 r/min的速度离心5min，分离收集白细胞层，用L-15培养基调整细胞浓度至1.0×105个细胞/m l，作为血液中吞噬细胞液。分别在0.5m l头肾和血液吞噬细胞液中添加0.2 m l经福尔马林灭活的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，简称F-SA），置25℃水浴中孵育40 min后，涂片，Giemsa染色，镜检。依照下式计算各种吞噬细胞的吞噬百分比（phagocytic percentage，PP）和吞噬指数（phagocytic index，PI）。

1.3.3 杀菌活性的测定

参照陈昌福（1997）的方法进行。即在盛有0.5ml头肾或血液吞噬细胞液的试管中分别添加0.2 ml A.hydrophila活菌，在25.0℃水浴中孵育40min后，加入1.0ml L-15培养基，以600 r/min离心10min的方法清洗吞噬细胞3次，弃上清后再添加0.3ml 0.2%的Tween 20（Difco产品）水溶液并摇动5min，使吞噬细胞破碎，加入2.0ml BHI，在25℃培养箱中培养16 h，每支试管中加入0.05 ml浓度为5.0 mg/ml的MTT（Monotetrazolium，日水产品）溶液，摇动15 min后用751分光光度计于600 nm处测定光密度值，并且依下式评价受免和对照鱼的吞噬细胞对A.hydrophila活菌的杀菌活性（bactericidalactivity，BA）。

杀菌活性（BA）＝

试验鱼吞噬细胞还原的MTT的光密度值。

对照鱼吞噬细胞还原的MTT的光密度值

2 结果与分析

2.1 凝集抗体效价

受免和对照团头鲂血清中凝集抗体效价和交叉凝集抗体效价的测定结果如表1所示。从表1可以看出，用3种不同的菌体粗LPS注射接种团头鲂后，受免鱼血清中凝集抗体效价和交叉凝集抗体效价均迅速地上升，各受免组团头鲂血清中的凝集抗体效价和交叉凝集抗体效价均于接种后第14 d内达到高峰，随后逐渐下降，而对照组团头鲂血清中的凝集抗体效价和交叉凝集抗体效价都很低。受免组和对照组团头鲂血清中的凝集和交叉凝集抗体效价水平具有极显著差异（P＜0.01），而3 个免疫组之间则差异不显著（P＞0.05）。

2.2 血液和头肾中吞噬细胞的吞噬活性

受免和对照团头鲂血液和头肾中吞噬细胞对FSA的吞噬活性测定结果如表2所示。由表2可以看出，采用3种不同的菌体粗LPS注射接种团头鲂后，多数受免鱼血液和头肾中吞噬细胞的PP和PI逐渐上升，并且总的趋势是于免疫接种后14 d左右达到峰值，受免鱼血液和头肾中吞噬细胞的PP和PI值，均极显著地高于对照组（P＜0.01）。

表1 受免和对照团头鲂血清中凝集抗体效价和交叉凝集抗体效价

表2 受免和对照团头鲂血液和头肾中吞噬细胞对F-SA的吞噬活性

2.3 血液和头肾中吞噬细胞的杀菌活性（见表3）

对受免和对照团头鲂血液和头肾中吞噬细胞的杀菌活性的测定结果如表3所示。由表3可以看出，经3种不同菌体粗LPS注射接种团头鲂后，受免团头鲂血液和头肾中吞噬细胞的杀菌活性均显著地高于对照组（P＜0.05），但是各免疫组之间的差异则不显著（P＞0.05）。

表3 受免和对照团头鲂血液和头肾中吞噬细胞的杀菌活性

3 讨论

关于鱼类致病菌菌体粗LPS对鱼类免疫原性的研究已有较多报道。但是，除黄辨非等（2002）对异育银鲫（Carassius auratus gibelio）的研究中注意到了3种弧菌的LPS存在共同抗原外，其他的研究者尚未注意到各种鱼类致病菌菌体粗LPS上的共同抗原问题。

陈昌福等（2000）的研究证明，当对鳜（Siniperca chuatsi）接种F.columnare或者迟缓爱德华菌（E.tarda）的菌体粗LPS后，受免鱼能增强对A.hydrophila活菌攻毒的抵抗力。在本研究中，经接种3种不同细菌的菌体粗LPS后，受免团头鲂的血清中均产生了不同水平的交叉凝集抗体效价，说明在3种细菌的菌体粗LPS上存在着一定数量的共同抗原，并且这些共同抗原对供试鱼具有较强的免疫原性。至于这些共同抗原能否诱导受免鱼类产生交叉免疫保护力，尚有待进一步研究。

对鱼类接种疫苗后观察其免疫应答水平时，大多数研究者是将试验鱼饲养在人工控制的实验室水族箱中进行的，但是，实验室内过多的人为因素对实验鱼造成的各种胁迫，对实验鱼免疫应答过程的影响往往是研究者难以预测和准确评估的。本研究中将试验鱼饲养在野外的生产性网箱中进行，虽然难以完全避免人为因素对试验鱼免疫应答过程的影响，但是，如果采用本试验结果评估鱼用疫苗在实际生产中的应用状况，就可能因为有效地减少了试验误差而更为准确。

12篇，刊略，需者可函索）

（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）

2010-02-22