新疆狗牙根种质遗传多样性的SSR分析

高文伟,李培英,孙宗玖,张延辉,阿不来提·阿不都热依木,黄超凡,李 楠

（新疆农业大学生物技术重点实验室,新疆乌鲁木齐 830052）

狗牙根（Cynodon dactylon）又名百慕大草、铺地草,属禾本科画眉草亚科虎尾草族,原产于非洲,分布在热带、亚热带和温带沿海地区,是全球暖季型草坪草中坪用价值最高,应用最广泛的草种之一[1-6]。在我国,狗牙根广泛分布于新疆和黄河流域及其以南地区[1,3,5-6]。区域间引种和国内选育的一些新狗牙根品种,使得目前我国狗牙根资源之间的亲缘关系模糊,因此有必要对狗牙根种质资源的遗传多样性进行研究[1-6]。

目前关于狗牙根的遗传多样性的研究主要基于表型性状的观测。张小艾和张新全[4]对西南区野生狗牙根的20个外部形态指标进行观测,结果发现相对于一个形态指标,材料存在显著差异,变异系数范围较大。但形态学性状易受环境和人为因素的影响,对遗传变异的检测有限。近年,对狗牙根遗传多样性的分子标记研究也初见报道,常用的 DNA 分子标记有 RFLP、RAPD、AFLP、SSR和ISSR等,它们各有优缺点。简单序列重复（simple sequence repeat,SSR）亦称微卫星（microsatellite）技术,是指由2～6个碱基组成的基本序列串联重复组成的短片段,为共显性标记。由于该技术具有简便、快速、稳定性高和等位基因多样性高等特点,在基因组研究中作为一种主要的分子标记技术,在玉米（Zea mays）、小麦（Triticum aestivum）、棉花（Gossypium hirsutum）等植物遗传图谱的构建、比较基因组研究、遗传多样性分析和系统学研究之中的研究应用较广,而在草坪草方面研究较少。

本研究以搜集到的70份新疆狗牙根种质资源为材料,采用SSR技术检测狗牙根种质资源的遗传多样性,分析狗牙根不同居群间的亲缘关系,旨为科学地保护和合理地开发与利用新疆狗牙根种质资源及狗牙根的育种研究提供理论依据。

1 试验地概况

试验地位于新疆乌鲁木齐市新疆农业大学试验场,海拔 850 m,年均温6.5℃,年极端最高38.8℃,极端最低温-41.5℃。冬季有积雪,年降水量230 mm,年蒸发量2 570 mm,土壤结冻期为11月中旬,解冻期为3月中旬,无霜期150 d左右。试验前该地多年种植玉米,土壤为荒漠灰钙土,肥力中等,有灌溉条件。

2 材料与方法

2.1 试验材料供试的狗牙根材料共70份,其中19份来自新疆农业大学,51份来自疆内各地区。各材料的采集地见表1。

2.2 试验方法

2.2.1基因组DNA提取 参照传统CTAB法并进行改良,具体方法如下:1）用液氮将研钵预冷,取200 mg幼嫩叶片,加入液氮快速研磨,研磨至灰白粉末 。2）加入800μ LDNA提取缓冲液、200μ L 10%的 SDS 和 50 μ L β-巯基乙醇 ,放置在振荡机上振荡15～30 s。于65℃水浴30 min,每10 min轻柔摇匀一次。3）取出后加入300 μ L KAC,冰浴 30 min。4）加入 700 μ L 氯仿/异戊醇（24∶1）,缓慢 混匀,12 000 r/min离心10 min,取600 μ L上清液。5）加入等体积异丙醇,于-20℃冷却 60 min,取出后以 8 000 r/min离心 5 min,弃上清 。6）加入 600 μ L 70%乙醇,洗涤 2～3次。7）晾干,加入 50 μ L TE 缓冲液,溶解后于-20℃保存备用。

表1 供试材料

2.2.2DNA浓度和纯度的检测 随机选取狗牙根无性系健康幼叶。用改良CTAB法提取其基因组DNA。用0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度。合格的DNA样品于4℃冰箱内保存备用。

2.2.3SSR体系的建立 PCR反应体系为10 μ L,其中 :10 ×buffer 2 μ L 、0.2 mmoL/L dNTPs 0.5 μ L 、引物 0.5 μ L 、Taq 酶 0.3 μ L 、双蒸水 4.7 μ L 、模板 DNA 2 μ L 。

热反应条件为:95℃预变性2 min,94℃变性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸1 min,共做30个循环,72℃延伸7 min,4℃保存。扩增产物用10%的聚丙稀酰胺凝胶电泳检测,银染显色。

2.3 数据统计分析SSR分析中,在相同的迁移位置上,有带赋值1,无带赋值0,缺失记为9；建立数据库。按UPGMA方法进行聚类作图,数据处理用NTSYS-pc（V2.1）软件完成。多态性信息量（PIC）按Smith等的公式计算。

式中,fi为i位点的基因频率。

3 结果分析

3.1SSR多态性分析

3.1.1SSR标记体系分析 如图1所示,用改良的CTAB方法提取的狗牙根DNA电泳谱带,主带明亮清晰、一致,基本无降解。

图1 狗牙根DNA琼脂糖凝胶电泳检测

采用新疆农业大学生物技术重点实验室确立的适合狗牙根的SSR反应体系,本试验SSR-PCR扩增的反应条件和反应体系能得到各样本的谱带,主带清晰,易于区分（图 2）。因此,该体系能应用于狗牙根的SSR-PCR扩增分析。

图2 引物P1扩增的SSR带型

3.1.2SSR标记分析 在Genebank中搜出狗牙根的相关基因片段序列,利用primer5.0及相关遗传分析软件,设计出11对狗牙根的SSR引物对。以本试验不同类型的狗牙根材料为模板,用11对引物进行PCR扩增,根据扩增结果进行比对、筛选引物。筛选原则是扩增条带数较多,条带清晰的引物,且PIC＞0.5。

本研究初步确定11对SSR引物多态性引物。利用筛选的11对引物对70份狗牙根供试材料进行SSR-PCR扩增,共扩增出55个位点,每对引物检测到3～6个等位基因,平均每对引物检测到5个等位基因。每个SSR位点的多态性信息量（PIC）在0.65～0.83,平均 0.78,其中引物 P2、P3、P7位点的 PIC最大（0.83）,P11位点最小（0.65）（表2）。由于这70份材料分别来源于新疆多个市（县）的不同地理位置,代表了研究新疆野生狗牙根的部分区域,另外也包括少部分优选系,但这些优选系由于选育时间较长又在区内不同地区之间进行交换种植,很难说它们遗传性状不会发生变异。以上结果表明:新疆野生狗牙根不同居群间,优选系的不同居群间存在着复杂的遗传背景,也存在着丰富的遗传多样性。

表2 狗牙根SSR标记的多态性

3.2 聚类分析根据狗牙根材料的扩增产物电泳图,构建引物在不同材料间的基因指纹图谱和相似系数矩阵。通过NTSYS软件分析70份狗牙根种质材料的遗传多样性和亲缘关系,聚类分析结果见图3。各材料间遗传相似性系数为0.50～0.84,均值为0.67。选取 0.55为阈值,70份材料大体上可分为4个类群。第Ⅰ类群包括48份材料（序号:1-12 、14-19 、27-29、32-42、44、46-51、53-61）,其中新疆农业大学有9个材料,托克逊县3个,察布查尔县6个,吐鲁番市3个,伊宁市4个,哈密市3个,霍城县3个,岳普湖县3个,疏勒县2个,昌吉市园艺场1个,莎车县2个,喀什市2个,泽普县、阿克陶县、英吉沙县、库尔勒市、鄯善县、博乐市、叶城县各1个；各材料间遗传相似性系数为0.56～0.84,均值为0.70；该类群采集地的生态环境为近水边或冷凉多水区域,叶片类型为宽叶匍匐类型。第Ⅱ类群包括13份材料（序号:13、20-26 、30、31、43、45、52）,其中阿图什3个,吐鲁番市2个,呼图壁县2个,托克逊县3个和乌苏市、昌吉市、新疆农业大学各1个；各材料间遗传相似性系数为 0.57～0.78,均值为0.68；该类群采集地的生态环境为近荒漠或干旱缺水区域,叶片类型为窄叶直立类型。第Ⅲ类群1份材料,来自新疆农业大学优选系材料（序号:62）,与第Ⅳ类群间遗传相似性系数为0.54。第Ⅳ类群8份材料,来自新疆农业大学优选系材料（序号:63-70）,各材料间遗传相似性系数为0.58～0.72,均值为0.65。第Ⅲ、Ⅳ类群为从资源圃中选择的自然变异类型,因此,与前2类有明显的差异。由此可见,SSR标记聚类结果与狗牙根材料的地理来源有一定的相关性,资源遗传关系与生态分区间有明显的联系,即在自身进化传播过程中,在某一生态环境下,狗牙根经过长期自然、人工选择和改良后,在遗传结构上发生了能够区别于其他生态区资源的变异。同时也说明了在新疆境内的狗牙根资源中,各地区的狗牙根材料有一定的遗传相似性,但是又相对独立,如在4类中每一类都有1个较为独立的狗牙根材料,如第Ⅰ类群中的3号材料、第Ⅱ类群中的20号材料、第Ⅲ类群中的62号材料、第Ⅳ类群中的70号材料。还有通过新疆农业大学的优选系材料来看,优选系间遗传差异不大的原因可能与长期的系统选择有关。

4 讨论与结论

图3 70份狗牙根的UPGMA聚类树状图

由于狗牙根属是一个种类繁多,形态变异复杂,含有二倍体、三倍体、四倍体和六倍体的多年生禾草,无论是从形态学还是细胞学水平上进行的分类都是受几个形态特征或生理生化特性的基因控制,它们在该物种遗传信息中所占比例很小,所以这些分类都有其局限性。因此,狗牙根属分类很困难,至今没有一个完善的分类方法[2-3]。近年来发展起来的分子标记技术可以对基因组的所有序列直接分析,检测基础序列的变化,在DNA水平上揭示群体的遗传变异,所以利用分子标记指纹图谱建立的UPGMA系统树可以反映种内或种间关系、居群间关系和基因组间的关系[1-15]。

本研究表明,11对引物在70份材料之间均具有多态性,每个SSR位点的多态性信息量（PIC）在0.65～0.83,平均0.78。狗牙根基因组DNA多态性明显偏高的特点,可以进一步证实众多研究者从生态等角度发现的狗牙根种内拥有大量可供遗传变异选择的基因型,这些丰富的遗传变异的存在,正是狗牙根能形成众多品种（系）的分子基础[3,5-6,10,15]。聚类分析表明,新疆境内的狗牙根资源中,各地区的狗牙根材料有一定的遗传相似性,但又相对独立。70份材料聚为4类群,其中Cd071（序号:62）单独聚成 1类,野生材料聚为2类；新疆农业大学优选系（序号:63-70）聚为1类。这种聚类不完全符合地域性分布规律的原因可能有2个方面:一是基因突变物种在进化过程中,有个别的基因发生了变异,且该突变体能较好地适应当地的环境,这个变异基因就能得到保存；二是以狗牙根顽强的无性繁殖能力,流水冲刷和人类活动等都可能使其转入异地扩展繁殖。这就要求在收集、保护狗牙根种质资源时,应尽量保证其生态和地理环境的多样性。鉴于狗牙根是异花授粉植物,在广泛收集种质资源的同时,一定要注意采取不同措施进行种质隔离,避免传粉引起种质资源混淆。

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