影响始基卵泡启动募集的调控因素*

李 爽 马灵芝 夏 天 夏 阳

始基卵泡是女性的基本生殖单位，也是卵细胞储备的唯一形式。自胚胎16周至出生后6个月，卵巢内单层梭形前颗粒细胞围绕初级卵母细胞形成始基卵泡。随着始基卵泡池的建立，始基卵泡就开始了启动和凋亡的过程。始基卵泡的募集分为启动募集和周期募集。启动募集是指始基卵泡在卵巢内因子以及未知的调控机制作用下脱离始基卵泡池向初级卵泡转化，此阶段不受促性腺激素影响。周期募集是指在每个月经周期中，当内分泌环境（主要指促性腺激素分泌情况）发生变化时，能够对这种变化发生应答的卵泡开始转变为次级卵泡。始基卵泡的启动募集过程分为两个阶段：第一阶段为前颗粒细胞由扁平状向立方状转变，并伴随颗粒细胞的增生；第二阶段为卵母细胞体积增大和颗粒细胞的继续增殖。始基卵泡的募集过程直接影响了女性一生中能够提供的卵子数量，在卵巢生物学上有很重要的意义。本文对目前研究较多的几种影响始基卵泡启动募集的因素进行综述如下。

1 始基卵泡的启动募集不受下丘脑-垂体-卵巢轴直接调节

始基卵泡的启动募集与促卵泡生成素（follicle stimulating hormone，FSH）和黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）无关。到次级卵泡阶段才出现FSH和LH受体，因此始基卵泡中没有功能性的FSH和LH受体。垂体切除的大鼠、小鼠的始基卵泡同样可被启动募集，并发展为初级卵泡。Braw等[1]研究表明，在不添加FSH和血清的条件下，体外培养的鼠、兔、牛和羊的始基卵泡均可进入生长池。因此可以证明FSH和LH不参与始基卵泡的启动募集，始基卵泡的启动募集主要受卵巢局部调节因子的控制。

2 卵巢局部调节因子

2.1 始基卵泡生长促进因子 干细胞因子（stem cell factor,SCF）属于白细胞介素-6家族成员，是最早发现的能够促进始基卵泡募集的旁分泌因子。因SCF是酪氨酸激酶受体（c-Kit）的配体（ligand of c-Kit receptor,KL），因此 SCF 又称 KL。KL及其受体在卵巢组织的表达存在物种差异性。山羊卵巢组织中各级卵泡的颗粒细胞内均可检测到KL mRNA和蛋白，卵母细胞内则检测到c－Kit mRNA和蛋白[2]。在人卵巢中，颗粒细胞、卵泡膜细胞、间质细胞和卵巢上皮细胞均产生KL。c-Kit则主要表达于卵母细胞，同时在人的卵巢颗粒细胞和卵泡膜细胞上也检测到了c-Kit的表达,表明除颗粒细胞与卵母细胞之间相互作用以外，KL还可能直接作用于颗粒细胞和卵泡膜细胞并调控其生长分化，从而间接调控卵母细胞的生长发育。但近年来的研究表明，不同物种间KL及其受体对卵泡发育的作用不尽相同。Hutt等[3]对家兔的研究表明，虽然在卵泡早期发育过程中KL及其受体具有促进家兔卵母细胞生长的作用，但却无启动始基卵泡发育的作用。Moniruzzaman等[4]研究证实KL与猪始基卵泡的启动和发育无明显相关性,而仅与维持卵母细胞存活、发挥抗卵母细胞凋亡有关。Carlsson等[5]也用不同浓度的KL与卵巢组织体外共同培养,结果外源性KL不能增加初级卵泡数，也不能提高体外培养中各级生长卵泡数；阻断KL作用后，体外培养卵巢组织中各级卵泡凋亡率增加，因此外源性KL可能仅与卵泡早期发育中的抗凋亡有关。

碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是成纤维细胞生长因子超家族成员之一。目前已经发现5种形式的bFGF，其中分泌到胞外的主要是分子质量为18 ku的bFGF，也是目前研究最多的bFGF[6]。在小鼠卵巢中，bFGF在所有阶段的卵母细胞中均有表达。在人类卵巢中,bFGF及其受体FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4在各阶段卵泡卵母细胞均有表达，在青春期后的女性卵巢颗粒细胞也有表达。bFGF是一种强有力的有丝分裂原，是诱导始基卵泡募集的重要细胞因子，它能够调节颗粒细胞的有丝分裂、分化、凋亡及甾体激素的合成，刺激卵泡膜细胞和间质细胞生长，通过作用于周围的颗粒细胞促进始基卵泡向初级卵泡转化。此外，bFGF还以旁分泌途径影响卵泡内膜细胞血管的发生。

白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）是白细胞介素-6家族成员，其可调节多种组织和细胞的生长及凋亡。Nilsson等[7]对大鼠卵巢内LIF的研究表明，在始基卵泡和初级卵泡阶段，LIF在颗粒细胞及周围体细胞中的表达高于卵母细胞；而在次级卵泡中，LIF主要在卵母细胞中表达，而在颗粒细胞及周围的体细胞中的表达很少。LIF促进始基卵泡募集，抗LIF抗体可降低自发的始基卵泡的转化率。该实验还发现LIF能上调颗粒细胞KL的表达，而对始基卵泡颗粒细胞的生长没有直接影响，以此推测LIF可能是通过促进颗粒细胞产生KL来促进始基卵泡向初级卵泡的过渡。

骨形态发生蛋白（bone morphogenic proteins，BMP）属于转化生长因子-β超家族成员。第一个显示与始基卵泡发育相关的BMP是BMP－15。BMP－15与其他家族成员不同，缺乏形成共价二聚体的半胱氨酸残基，由卵母细胞分泌[8-9]。在人类始基卵泡、初级卵泡和次级卵泡，甚至成熟卵泡中均有表达[10]。BMP-15作为颗粒细胞有丝分裂的刺激因子，主要通过促进颗粒细胞减数分裂、刺激KL的表达来影响早期卵泡的发育。在以后的发育中BMP-15也可以通过自分泌或旁分泌的方式影响卵泡的闭锁以及优势卵泡的选择[11]。BMP-4是由间质细胞分泌的维持始基卵泡存活的必需因子，其作用于邻近的颗粒细胞，可以显著增加始基卵泡向初级卵泡的转化率。BMP-4不但可以提高FSH诱导的颗粒细胞分泌雌二醇，抑制孕激素的分泌，而且还可以与激活素、促性腺激素释放激素相互作用从而调节促性腺激素的分泌[12]。动物实验显示向培养液中加入BMP-4中和抗体后,卵巢细胞减少的同时凋亡细胞相应增加，卵巢体积缩小，正常形态丧失；人体试验也得出相似结论[13]。

生长分化因子－9（growth differentiation factor－9，GDF－9）也是转化生长因子－β超家族成员。其在自始基卵泡起的各阶段卵母细胞中均有表达。Wang等[14]发现GDF-9促进始基卵泡形成，用GDF-9的小干扰RNA抑制GDF-9活性可以抑制始基卵泡的形成。Juengel等[15]在对牛的研究中发现，GDF-9是调节卵泡正常发育和排卵的关键因素。最新的研究表明，卵母细胞通过GDF-9调节卵丘胆固醇的合成[16]。Gilchrist等[17]进一步研究表明，当卵母细胞缺乏胆固醇时，卵母细胞源性的GDF-9通过促进卵丘合成胆固醇来弥补卵母细胞中胆固醇产生的不足，证明卵母细胞和卵丘间具有双向调节作用。GDF-9对卵泡膜细胞功能方面也有重要的调节作用，并且小的卵泡膜细胞比大的卵泡膜细胞对GDF-9更加敏感[18]。Shi等[19]研究表明GDF-9可调控激活信号传导通路的关键部分，通过增强细胞对激活素A的反应性，从而增强激活素A诱导的抑制素B在人类颗粒细胞的产生。

角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF）是成纤维生长因子家族成员，由新募集的前体膜细胞产生，作用于临近的颗粒细胞，是目前发现的第一个发育中的前体膜细胞标志物。发育中始基卵泡的前体膜细胞能产生KGF，KGF又作用于邻近颗粒细胞使其产生KL，KL有助于募集前体膜细胞，产生KGF的同时也增强了KL的表达，从而产生正反馈回路。

表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）是由153个氨基酸组成的单链多肽。在羊的始基卵泡和初级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞均表达EGF mRNA和蛋白[20]。在人类的卵巢中，EGF在始基卵泡和初级卵泡的卵母细胞中表达量较高，在初级卵泡的颗粒细胞以及各级卵泡的卵泡膜细胞中表达量也较高。EGF在人类始基卵泡募集和卵泡的发育过程中起重要作用，其可促进静息细胞表达增殖细胞核抗原（PCNA），导致细胞周期改变，促进细胞增殖，使卵泡进入生长相。同时EGF也能刺激始基卵泡类固醇激素的分泌。柳海珍等[21]以PCNA为指标，研究EGF和FSH对新生大鼠始基卵泡生长启动的作用，结果显示，EGF能促进始基卵泡前体颗粒细胞增殖分化，而FSH对始基卵泡生长启动则不发挥作用。

胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor,IGF）系统是一组多功能细胞增殖调控因子，由2类多肽生长因子（IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ）、2类IGF受体（IGFR-Ⅰ、IGFR-Ⅱ）和至少7种结合蛋白（IGFBPs）及IGFBP特异性蛋白分解酶构成，因其化学结构与胰岛素原类似而得名。Louhio等[22]研究表明雄激素通过促进始基卵泡卵母细胞表达IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGFR-Ⅰ和IGFR-Ⅱ参与始基卵泡的启动过程。IGF-Ⅰ和IGFR-Ⅰ可介导雄激素促进早期卵泡发育。IGF-ⅡmRNA在卵母细胞任何发育阶段上均高表达，在卵泡发育的起始阶段，IGF-Ⅱ不仅与IGFR-Ⅱ，还可与IGFR-Ⅰ结合，通过两种不同途径传递信号，激活抗凋亡基因，促进始基卵泡的颗粒细胞和卵母细胞的发育。

2.2 始基卵泡生长抑制因子 抗苗勒激素（anti-Müllerian hormone,AMH）是转化生长因子－β超家族成员，是目前发现的唯一抑制始基卵泡募集的生长因子。人类AMH最初表达于初级卵泡的颗粒细胞，在窦前卵泡及小窦状卵泡中表达最强，随着卵泡逐渐增大，AMH表达量也逐渐减少，当卵泡直径＞8 mm时，AMH表达几乎完全消失，仅在卵丘的颗粒细胞中有少量残存。AMH可抑制体外培养的新生卵巢始基卵泡的募集。Durlinger等[23]通过添加AMH和不添加AMH体外培养新生小鼠卵巢的研究表明，2日龄新生小鼠的卵巢中含有始基卵泡和裸卵，但不含生长卵泡；而添加AMH实验组经体外培养2 d或4 d后发现生长卵泡数量较对照组减少40%～50%。实验还发现，AMH基因缺失的小鼠出生25 d后卵巢内生长卵泡数量较同窝小鼠明显增多，至4月龄时卵巢内生长卵泡数目是正常小鼠的3倍，并且始基卵泡数明显减少，最终导致始基卵泡池过早耗竭。大量实验表明，AMH可作为始基卵泡生长抑制因子，抑制始基卵泡的启动募集。作为旁分泌因子，AMH的分泌不受促性腺激素的调控。体外受精的患者给予单一、大剂量的促性腺激素释放激素激动剂后，尽管内源性FSH及LH水平均升高，但AMH含量却未受到影响。Wouter等[24]通过观察44例正常月经周期妇女整个月经周期中血清AMH水平的变化发现，AMH水平在月经周期的各个阶段均无实质性波动。Kevenaar等[25]研究发现，小鼠卵巢内生长卵泡数目与始基卵泡数目呈明显相关性，血清中AMH水平与生长卵泡及始基卵泡的数目呈强相关性。所以AMH不受促性腺素影响，也不受月经周期的限制，又可相对地反映始基卵泡池的存量，因而AMH也可作为卵巢储备的标志之一。

3 始基卵泡细胞之间的相互作用

始基卵泡的启动募集不受促性腺激素的调节，因而其卵巢内部的生长环境尤为重要。由卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞构成的卵巢微环境是卵泡发育的重要场所。严密的信号传导结构和交错的信息调节网络是卵泡启动和发育的必备条件。在结构方面，始基卵泡细胞之间为了相互传递信息的需要，在卵泡细胞之间、卵母细胞和颗粒细胞间、颗粒细胞之间、颗粒细胞和卵泡膜细胞间建立了广泛的信号联系，这些信号联系参与调节始基卵泡的启动募集过程。透明带是卵母细胞和颗粒细胞间主要的物质、能量及信息交换结构。缝隙连接是卵丘颗粒细胞形成的突出物穿过透明带与卵母细胞表面的突起形成的接触。构成缝隙连接的主要成分和标志物是连接蛋白。同样参与卵泡早期生长启动的重要因素还有细胞黏附分子E-钙黏素、P-钙黏素等。这些细胞之间的相互联系在始基卵泡的启动过程中都起了重要的作用。体外培养表明，将不成熟的卵母细胞与颗粒细胞分离培养时，二者均不能生长；共培养时，卵母细胞与颗粒细胞间自动形成缝隙连接，这与它们在卵泡中的空间结构相似。在信息调解网络方面，卵泡细胞间存在复杂的信号传导系统。始基卵泡细胞之间通过细胞因子相互作用调节始基卵泡的募集。卵母细胞产生的细胞因子bFGF作用于颗粒细胞和卵泡膜细胞上的bFGF受体，使颗粒细胞和卵泡膜细胞增生；同样的颗粒细胞分泌的KL也作用于卵母细胞和卵泡膜细胞，调节始基卵泡的募集。Eppig等[26]将次级卵泡的卵母细胞取出植入到始基卵泡内，始基卵泡迅速生长，颗粒细胞分化加快，并且卵母细胞发育正常，能够受精形成胚胎，说明卵泡细胞之间具有双向调节作用。不仅卵泡细胞之间具有信息调节作用，各种细胞因子之间也形成各种相互交错的调节网络。研究表明BMP-15与KL之间存在负反馈调节系统，Otsuka等[27]在体外培养小鼠卵泡细胞发现，卵母细胞产生BMP-15促进颗粒细胞表达KL，而过量的KL反过来又抑制卵母细胞表达BMP-15，两者之间形成双向的调节环路，共同调控始基卵泡的启动募集。

卵泡的启动受多种自分泌和旁分泌等因素的影响，是一个极其复杂的过程。探讨卵泡发育的本质和卵巢局部调节因子对卵巢微环境的作用，对揭示始基卵泡的启动机制和卵母细胞的体外成熟大有裨益。

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