黄连解毒汤对APP/PS1双转基因AD小鼠海马区病理形态学及脑内β-APP基因mRNA的影响＊

邱昕,陈国华,冯佩,汪弢,梅瑰,王月古,邵卫,张忠文,潘宋斌

华中科技大学同济医学院附属中西医结合医院神经内科,武汉430022

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的发病率急剧上升[1],现代研究证明,β淀粉蛋白(amyloid β,Aβ)的沉积在AD的病理生理过程中起重要作用,不仅对神经元产生直接毒性,还可诱发脑内一系列病理改变[2-4]。分子遗传学研究显示,多种AD相关基因中APP第一个被发现,它是由定位于21号染色体长臂上的基因编码的含有695～770个氨基酸残基的跨膜蛋白。人类 APP基因含有 19个外显子(exons 1～13,13a,14～18),AD患者脑内老年斑的主要成分是由APP基因的16～17外显子编码的APP水解片段 Aβ肽[5]。抑制β-APP基因的表达,能有效预防AD发生[6]。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物：3月龄SPF级APP/PS1双转基因AD小鼠50只,体质量(30±5)g,合格证号为2005674,由南京大学动物模式所提供,饲养于SPF屏障实验饲养室。②主要试剂与材料：黄连解毒汤(huanglian jiedu decoction,HLJDD)(由华中科技大学同济医学院附属中西医结合医院中心实验室提供);盐酸多奈哌齐(安理申,卫材中国药业有限公司生产)5 mg/片,批号为 H20050978;Trizol试剂(购于Invitrogen公司);逆转录试剂盒(购于TOYOBO公司);其它试剂为国产分析纯;Mr23i台式低温高速离心机(购于HERAUS公司);实时定量聚合酶链反应检测系统(realtime PCR detection system)(购于 SLANHONGSHI公司)。

1.2 方法

1.2.1 药品制备 HLJDD由黄连、黄芩、黄柏和栀子组成,按处方配伍的生药粉碎后用水提取,提取液过滤,滤液静置,高速离心得到沉淀Ⅰ;滤液通过大孔吸附树脂过滤,烯醇洗脱部分,真空浓缩干燥,得到固体Ⅱ。将沉淀Ⅰ与固体Ⅱ进行均匀混合,得到有效部位,总得率为7.6%。分离分析显示所得有效部位的化学成分主要为生物碱类、黄酮类、环烯醚萜类。利用分光光度法分别测定生物碱类、黄酮类、环烯醚萜类成分的含量,用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定其指标性成分小檗碱、黄芩苷、栀子苷的含量。有效部位(群)的总含量＞55%,指标性成分(群)的总含量＞25%。HLJDD与安理申给药前均用 0.5%羧甲基纤维素钠(carboxymethyl cellulose,CMC)混悬。

1.2.2 分组及干预 50只小鼠随机分为对照组、安理申组、HLJDD大剂量组、HLJDD中剂量组、HLJDD小剂量组各10只。正常饲喂1周后,对照组给予0.5%CMC灌胃,安理申组给予安理申3 mg/(kg◦d)混悬液灌胃,HLJDD大剂量组给予 HLJDD 865 mg/(kg◦d)混悬液灌胃,HLJDD中剂量组给予HLJDD 433 mg/(kg◦d)混悬液灌胃,HLJDD小剂量组给予HLJDD 216 mg/(kg◦d)混悬液灌胃。每组均连续灌胃给药6个月。如有小鼠死亡,随机补足数量,并计算各组小鼠死亡率。

1.2.3 标本制备 6、10月龄时,每组各随机抽取2只小鼠,10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉,在4℃冰袋上快速取脑,冷生理盐水冲洗残血,拭干,浸入预冷的4%多聚甲醛固定、包埋,海马区冠状切片,厚度4 μ m,于60℃烤箱内烘烤2 h后备用。

1.2.4 HE染色 室温30℃,切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ各脱蜡5 min,然后经100%、95%、70%酒精梯度脱水各5 min,苏木素染色5 min,水洗,1%盐酸乙醇分化数秒,水冲洗回蓝,伊红染色1 min后水洗,再由低到高浓度脱水透明,中性树胶封片,光学显微镜下观察海马CA1区细胞形态。

1.2.5 改良甲醇刚果红染色 石蜡切片常规脱蜡脱水,苏木素染5 min后水洗,1%盐酸乙醇分化数秒后温水回蓝,水洗,甲醇刚果红染色15 min,水洗后0.2%碱性乙醇分化数秒,水洗,常规脱水、透明、封片,正置光学显微镜下观察,甲醇刚果红阳性斑块为老年斑,于100倍视野下随机选取3个视野,计数各组老年斑数量。

1.2.6 实时定量PCR 末次灌胃1 h后,断颈处死小鼠,快速取出两侧海马约50 mg放入研磨器,参照Trizol试剂说明书方法研磨20～30 min;将液体倒入灭菌后的EP管内,加三氯甲烷250 μ L,上下颠倒充分混匀,静置5 min,4℃离心,13000 rpm×10 min;取上清液于另一灭菌EP管内,加入等量异丙醇,混匀放入4℃冰箱 15 min后取出,4 ℃离心,13000 rpm×10 min;倾倒出上方液体,加入75%的乙醇1 mL,4℃离心,7500 rpm×5 min;倾倒上部液体,只剩白色沉淀;瞬时离心,尽量吸干管内液体,晾干,加入适量的去离子水溶解。内参基因上游引物：M-actin-S 5'-CCGTGAAAAGATGACCCAG-3',下游引物：M-actin-A 5'-TAGCCACGCTCGGTCAGG-3';目的基因上游引物：M-APP-S 5'-TGGCGGTGAAGACAAAGTAGTAG-3',下游引物：M-APP-A5'-CTCAGTGGTGGTTGTGGTGG-3'。所用引物设计软件：Primer Premier 5;M-actin核酸序列号：NM_007393.2,引物BLAST 的 结 果 ：http ：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi;M-APP核酸序列号：NM_007471.2,引物 BLAST 的结果：http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。总RNA提取、变性后,配置逆转录反应体系：RNA 1 μ L,5 ×逆转录缓冲液4 μ L,dNTP 2 μ L,Oliga(dT)201 μ L,去 RNA 酶水 10 μ L,RNA酶抑制剂1 μ L,ReverTra Ace 1 μ L;反应条件：42℃孵育20 min,95℃反应5 min,4℃反应5 min。配置PCR反应液：SYBR Green mix 12.5 μ L,引物(5 pmoL/μ L)2 μ L,双蒸水8 μ L,cDNA(1 ∶10)2.5 μ L;反应条 件 ：50℃孵育2 min,95℃反应 2 min后,经95℃变性15 s,退火15 s,72℃延伸45 s,40个循环,72℃延伸10 min。在循环过程中,通过实时PCR检测系统分析同时完成荧光检测。以β-actin 为内参照,按公式 β-APP/βactin计算β-APP mRNA水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 14.0软件处理数据,计量资料以(x-±s)表示,Fisher确切概率法、方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠死亡率比较 对照组、安理申组、HLJDD大剂量组、HLJDD中剂量组及HLJDD小剂量组分别死亡 3(30%)、4(40%)、1(10%)、1(10%)、1(10%)只,Fisher确切概率法分析显示,各组死亡率差异无统计学意义,推测 HLJDD未对小鼠产生毒性致死作用,安全性较高。

2.2 HE染色结果 HE染色显示,各组6月龄小鼠海马CA1区锥体细胞排列尚整齐,鲜见细胞空泡变性及坏死,各组间无明显差别。10月龄,对照组小鼠海马CA1区锥体细胞排列紊乱,部分细胞出现空泡变性,大量细胞出现固缩坏死;HLJDD大剂量组、小剂量组与安理申组间差异不大,海马CA1区锥体细胞排列较整齐,少量细胞出现空泡变性、固缩坏死;HLJDD中剂量组海马CA1区锥体细胞排列尚整齐,部分细胞出现空泡变性,未见细胞坏死,见图1A-C。

2.3 改良甲醇刚果红染色结果 6月龄时,仅对照组小鼠大脑皮质可见少量橘红色沉积物(老年斑),密度低,其余各组皮质、海马区均未见老年斑形成。10月龄,对照组小鼠皮质、海马区均可见大量老年斑沉积,面积增大。HLJDD大、中、小剂量组、安理申组及对照组老年斑数量分别为(3.0±0.5)个,(3.0±0.7)个,(6.0±0.8)个,(5.0±0.6)及(14.0±1.5)个,前4组均少于对照组(P＜0.05),见图2A-C。

2.4 β-APP基因mRNA水平检测结果 实时定量PCR检测显示,对照组、安理申组、HLJDD大剂量组、HLJDD中剂量组的β-APP mRNA的水平分别为(1.3308±0.0404)、(1.2852 ±0.0336)、(1.2714 ±0.0125)、(1.2604 ±0.0214)、(1.2918 ±0.0184),安理申组和HLJDD小剂量组低于对照组(P＜0.05),HLJDD大剂量组和中剂量组显著低于对照组(P＜0.01);HLJDD大剂量组低于安理申组(P＜0.05),HLJDD中剂量组显著低于安理申组(P＜0.01),HLJDD小剂量组高于安理申组(P＜0.05);HLJDD大小剂量组均高于 HLJDD中剂量组(P＜0.05),HLJDD大、小剂量组之间差异无统计学意义。

3 讨论

AD是起病隐袭、进行性发展的痴呆,是老年人最常见的神经退行性疾病,其脑部主要的病理学特征为老年斑、神经纤维缠结形成和神经元丢失等。目前研究普遍认为Aβ是老年斑的主要成分,大量Aβ聚集或沉积会形成老年斑,其周围局灶性炎症反应和炎性细胞因子的产生,使得Aβ和炎性细胞因子构成毒性环路,不断损伤神经细胞,最终导致神经退行性变[7]。Aβ的这种神经毒性作用,属于中医“毒”的范畴,有学者认为[8],“毒损脑络”在AD的发病中有重要作用,Aβ是“毒损脑络”机制中的启动环节。对于AD患者,经典的治疗方法主要针对其脑内胆碱能递质作用不足,采用以盐酸酸多奈哌齐为代表的胆碱酯酶抑制剂,改善AD患者的认知功能缺损,但这些药物会引起受体下调和脱敏,其长期使用的疗效并不理想。

HLJDD源于唐代王焘《外台秘要》,由黄连、黄芩、黄柏、栀子4味苦寒药物组成,是清热解毒方中的经典方剂。该方由黄连、黄芩、黄柏、栀子组成。方解认为该方集黄连、黄芩、黄柏、栀子大苦大寒之品于一方之中,以黄连泻心火为君,兼泻中焦之火;臣以黄芩清肺热,泻上焦之火;佐以黄柏泻下焦之火;使以栀子清泻三焦之火,导热下行;具有清热解毒之功效,正恰和AD“毒损脑络”的病机。方青等[9]发现,HLJDD能提高AD大鼠的学习记忆能力,其可能机制为调整AD大鼠的免疫功能和增加抗炎作用;国内研究显示,HLJDD可改善老年性痴呆(心肝火旺型)患者智力和生活能力,其作用机制可能与抗自由基有关。本研究以β-APP基因为出发点,研究HLJDD治疗AD的可能机制。组织病理显示,HLJDD和安理申均起到保护神经细胞,减缓细胞凋亡进程,减少老年斑沉积的作用,而HLJDD中剂量组的效果显著优于安理申组。也有研究表明,HLJDD可能通过调控快速老化模型小鼠海马基因的表达而发挥改善认知功能障碍的作用[10],与本研究结果有异曲同工之处。本研究结果还显示,中剂量HLJDD降低β-APP基因mRNA转录的效果明显优于安理申,提示中剂量HLJDD可能是治疗AD的有效剂量,可达到理想的血药浓度。HLJDD大剂量组疗效比中剂量组差,可能因中药具有双向调节作用,当药物浓度超过一定范围之后,极有可能对体内某种调节机制产生负反馈调节,其潜在机制有待进一步研究。本研究结果为今后摸索和制定中医复方HLJDD的合理治疗剂量提供科学依据。

综上所述,HLJDD能保护神经细胞,有效干预β-APP基因mRNA转录,减少老年斑生成,对 AD起防治作用。但 HLJDD对AD病多靶点、多途径、多机制的作用特点及是否还有其它作用机制有待于进一步探讨。

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