人牙周膜细胞群多向分化潜能的实验研究

刘娟 赵红宇 轩东英 谢宝仪 章锦才

（广东省口腔医院·南方医科大学附属口腔医院 牙周病科，广东 广州 510280）

人牙周膜细胞群多向分化潜能的实验研究

刘娟 赵红宇 轩东英 谢宝仪 章锦才

（广东省口腔医院·南方医科大学附属口腔医院 牙周病科，广东 广州 510280）

目的 研究体外培养的人牙周膜细胞群（hPDLP）向成骨和成脂方向分化的潜能，为牙周组织工程提供可靠的种子细胞来源。方法 组织块法分离培养人牙周膜细胞群，流式细胞术检测间充质干细胞标记CD146和STRO-1的表达；利用茜素红、油红O染色、免疫组化以及反转录聚合酶链反应（RT-PCR）等检测hPDLP的多向分化标志。结果 第1代hPDLP的CD146和STRO-1阳性率分别是27.20%±3.98%和4.23%±4.08%；经矿化诱导可以形成矿化结节，有钙盐沉积；经成脂诱导可见特异性脂滴形成，特异性转录因子过氧化物酶体激活物增生受体2（PPARγ2）和脂蛋白脂酶（LPL）表达上调。第8代hPDLP相对第1代的矿化能力没有差异，但成脂方向分化潜能减弱。结论 体外培养的hPDLP具有向成骨和成脂样细胞分化潜能，第1～3代细胞群明显具有牙周膜干细胞的多向分化潜能优势。

人牙周膜细胞群； 分化潜能； 矿化； 诱导

近年来，研究者[1-4]发现，牙周膜细胞具有异质性，包含异质性细胞群,即由不同的亚型组成,细胞间存在差异,在表现型及功能上有所不同,其子代能增殖产生成纤维细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞。这些细胞亚型可处于不同的分化阶段或具有不定向的分化趋势，牙周组织再生修复与牙周膜细胞的异质性有密切关系。牙周膜细胞作为一个细胞群体,具有很强的分化增殖能力，其中含有大量未分化的功能细胞。2004年Seo等从牙周膜中分离并培养了间充质样干细胞，发现这些细胞表面表达间充质干细胞的表面标记STRO-1和CD146/MUC18，体外培养能够形成牙周膜样结构，并首次提出了人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cell，hPDLSC）的概念。牙周膜干细胞同其他组织的成体干细胞一样，目前尚缺乏特异性的表面标记对其进行鉴定和分离纯化。本实验拟通过研究具有异质性人牙周膜细胞群（human periodontal ligament cell population，hPDLP）的多项分化潜能，揭示hPDLP的干细胞成分特征，为以牙周膜细胞群为种子细胞的牙周组织工程研究奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

DMEM培养液、FBS（Gibco公司，美国），胰蛋白酶、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、地塞米松（dexamethasone，DEX）、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠（β-glycerophyosphate，β-GP）、消炎痛、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤（3-isobutyl-1-methyl-xanthine，IBMX）、胰岛素、β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）（Sigma公司，美国），鼠抗人STRO-1多抗、鼠抗人CD146多抗（R＆D Systems公司，美国），CO2细胞培养孵箱（Heraeus公司，德国），超净工作台（苏州净化设备厂），低温高速离心机（Heraeus公司，德国），倒置显微镜及照像系统（Olympus公司，日本）。

1.2 组织块法细胞原代培养

收集临床上12～18岁因正畸需要拔除的牙周健康、无龋的新鲜前磨牙，拔除后立即在双抗PBS液和DMEM液中反复清洗牙齿，刮下根中1/3牙周膜组织，剪成0.5mm×0.5mm×0.5mm左右的小块。以5mm的间隔将所得的组织块均匀地接种在25 cm2培养瓶瓶底，翻转培养瓶，向内加入4mL DMEM培养基（含10%胎牛血清，100μmol·L-1抗坏血酸，2mmol·L-1谷胺酰胺，100U·mL-1青霉素，100μg·mL-1链霉素），置二氧化碳培养箱（5%CO2、100%湿度、37℃恒温）孵育2 h，使组织块贴壁，再翻转培养瓶培养，3 d后更换培养液，2～3 d换液1次，细胞汇合至培养瓶80%时用0.05%的胰蛋白酶消化传代。

1.3 免疫细胞化学染色hPDLP的表面抗体

取生长良好的第1代细胞制备细胞爬片,用SABC法染色进行波形丝蛋白Vimentin、角蛋白Keratin、STRO-1、CD146免疫组化染色，阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤不变，进行细胞来源及表达检测，光镜观察。

1.4 流式细胞表型分析hPDLP的表面标记

取对数生长期的第1～3代细胞，0.25%胰酶消化1min，1 000 r·min-1离心5min，弃上清液，调整细胞密度为每毫升1×106个，PBS洗2遍，加0.02mL的FCM缓冲液（含20 g·L-1牛血清白蛋白和0.1 g·L-1叠氮化钠）重悬，PE标记的STRO-1和FITC标记的CD146抗体避光4℃孵育20min，加0.2mL PBS重悬，流式细胞仪上机检测。

1.5 矿化诱导hPDLP

分别制备第1～3代和第8代hPDLP，接种到24孔板中，用10%FBS的DMEM培养,待细胞伸展至60%汇合后，换矿化诱导液（含10mmol·L-1β-甘油磷酸钠、50μg·mL-1维生素C、1×10-8mol·L-1地塞米松、10%FBS的DMEM培养液），每3 d换液1次，连续培养21 d。镜下观察细胞复层生长并出现圆形结节，以4 g·L-1中性甲醛固定，采用von Kossa和茜素红染色法进行矿化结节染色。

1.6 成脂诱导hPDLP和油红O染色

分别制备第1代和第8代hPDLP，接种到24孔板中，用10%FBS的DMEM培养，待细胞伸展至60%汇合后，换成脂诱导液（含1 mmol·L-1地塞米松，0.5mmol·L-1IBMX，100mg·L-1消炎痛，10mg·L-1胰岛素，10%FBS的DMEM）诱导培养3 d，脂肪维持液（含10 mg·L-1胰岛素和10%FBS的DMEM）培养1 d。经过3次循环后，细胞再培养于脂肪维持液中1周，选择2到3孔进行油红O染色，其余的加Trizol分装成1mL后存放至-70℃待用。

1.7 RT-PCR测定

为了进一步确认hPDLP经诱导是否成功向成脂方向分化，在转录水平检测相关基因过氧化物酶体激活物增生受体2（peroxisome proliferation activator receptor 2,PPARγ2）、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）的表达，3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参。收集诱导前后的细胞，按Trizol Reagent说明书提取细胞中总RNA，用SuperScriptTMKit从提取的RNA反转录合成cDNA第1链，参照文献合成下述引物进行RT-PCR检测（表1），产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，通过灰度值分析进行半定量。

表1 RT-PCR引物序列Tab 1 Primers used for RT-PCR and sequencing reaction

1.8 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，LSD法两两比较各代之间STRO-1和CD146阳性率的差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞生长情况

组织块法原代培养的人牙周膜细胞3～6 d后，可见多个组织块边缘有细胞开始游出，细胞形态无明显差别，大多数为长梭形成纤维状，1～2个突起；少数为多角形、纺锤状或椭圆形，体积较小，胞体丰满，生长较快，约7～14 d开始汇合，以组织块为中心呈放射状、螺旋状生长（图1）。生长的细胞以1∶2传代培养，最初5代的细胞培养3～5 d即可长满培养瓶瓶底，生长状态较活跃，核分裂象多见；6～12代细胞，培养7～10 d铺满，细胞增殖稳定。

图1 原代hPDLP培养10 d的生长状态 倒置相差显微镜×40Fig 1 The primary hPDLP cell growth state by tissue cultured for 10 days inverted phase contrast microscope ×40

2.2 细胞表型鉴定

免疫组化显示细胞波形丝蛋白染色阳性（图2），角蛋白染色阴性。第1代牙周膜细胞中部分细胞抗STRO-1和CD146染色着色，细胞表达STRO-1和CD146强弱不等（图3、4）。

2.3 流式细胞表型分析

流式细胞仪检测第1～3代的hPDLP，STRO-1阳性率分别为4.23%±4.08%、1.92%±1.77%和0.44%± 0.24%，LSD法比较两两之间差异无统计学意义（P＞0.05）；CD146阳性率分别为27.20%±3.98%、18.83%± 4.04%和10.61%±4.61%，LSD法比较两两之间差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 成骨诱导结果

矿化液连续培养10 d左右第1代细胞呈复层生长，明显增厚，为局灶状，中央出现许多颗粒样改变，并逐渐连接成片，密度增高。15 d左右孔板底部出现肉眼可见的针尖大小灰白色小结节，并逐渐增大，21 d后行von Kossa和茜素红染色可见大量染成棕褐色的片状矿化结节，周边界限不清（图5）。

图2 第1代hPDLP抗波形丝蛋白的阳性染色 SABC ×400Fig 2 Positive expression of Vimentin in the first generation of hPDLP SABC ×400

图3 第1代hPDLP抗CD146染色的阳性染色 SABC ×400Fig 3 Positive expression of CD146 in the first generation of hPDLP SABC ×400

图4 第1代hPDLP抗STRO-1的阳性染色 SABC ×400Fig 4 Positive expression of STRO-1 in the first generation of hPDLP SABC ×400

2.5 成脂诱导结果

第1代hPDLP经成脂诱导剂诱导，倒置显微镜下观察，可见部分胞质内有大小不一的脂肪滴形成，经油红O染色脂滴染成红色（图6）。第8代牙周膜细胞经脂肪诱导，倒置显微镜下虽也可见细胞胞质内有脂滴形成，但形成的量要明显少于第1代细胞（图7）。

图5 hPDLP矿化诱导21 d后矿化结节 茜素红染色 ×200Fig 5 Calcified nodules in the hPDLP cultured with mineralization induced medium for 21 d alizarin red staining ×200

图6 第1代hPDLP成脂诱导21 d后脂滴形成 油红O染色×400Fig 6 The formation of lipid droplets in the first generation of hPDLP cultured with adipogenic induction for 21 days oil red O staining ×400

图7 第8代hPDLP成脂诱导21 d后脂滴形成 油红O染色×400Fig 7 The formation of lipid droplets in the eighth generation of hPDLP cultured with adipogenic induction for 21 days oil red O staining ×400

RT-PCR结果表明在诱导的第1代细胞中存在转录，与预期条带大小一致，在诱导的第8代细胞中不存在转录（图8）。Tanon Gis图像分析系统测定各细胞印迹条带的灰度值，并进行半定量分析，将标准条带灰度值定为1，得到各条带相应灰度值。结果表明，未诱导第1代和诱导第8代细胞中不表达，诱导第1代细胞中表达。

图8 hPDLP成脂诱导后RT-PCR检测PPARγ2、LPL和GAPDH的mRNA表达Fig 8 The mRNA expression of PPARγ2,LPL and GAPDH of hPDLP cultured with induction medium by RT-PCR

3 讨论

近年来,随着成体干细胞研究的不断深入，采用成体干细胞作为种子细胞运用于口腔组织工程的研究逐渐展开。牙周膜干细胞同其他组织的成体干细胞一样，目前尚缺乏特异性的表面标记对其进行鉴定和分离纯化。Shi等[5]利用酶消化法通过有限稀释法克隆化培养纯化获得PDLSC，采用直接组织块法培养所得的细胞即为人牙周膜细胞群，首次对hPDLP和PDLSC的特性进行了对比研究，PDLSC细胞形态呈圆形或不规则形状，周边部细胞呈梭形或多角形，体积较小，部分细胞呈成纤维细胞状，hPDLP主要为胞体较大的成纤维样细胞和少量小而不规则形的细胞。hPDLP的概念逐渐明了，是含有干细胞成分的异质性细胞群，但是对其多向分化潜能的研究在国内外均少有报道。本实验通过研究hPDLP多向诱导分化潜能，进一步探索hPDLP在体外是否具有干细胞群的特征。

本实验通过组织块法获得的hPDLP主要为胞体较大的成纤维样细胞和少量小而不规则形的细胞，提示分离的细胞可能由牙周膜成纤维细胞和不同分化阶段的细胞共同组成，具有异质性，这与Gay等[6]的研究结果相似。目前已有研究证实了分离纯化的PDLSC具有成骨、成脂和成神经分化的能力[4，7]，且在传代过程中其增殖能力逐渐减弱，并可能丧失其多向分化潜能[8]。但是hPDLP是否具有干细胞的特性，在适当的条件和诱导因子作用下，能否向成骨细胞和成脂分化，在传代过程中其多向分化能力是否逐渐减弱，目前在国内未见相关报道。本实验基于此假设，验证hPDLP能否向成骨和成脂分化，采用分离培养的1～3代hPDLP进行了矿化和成脂分化的研究，同时对比了同一个样本的第8代细胞的矿化和成脂的分化能力。

实验中发现第1～3代和第8代hPDLP细胞在含β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松的矿化诱导液中, 10 d左右细胞呈复层生长，明显增厚，为局灶状，中央出现许多颗粒样改变，并逐渐连接成片，密度增高，21 d后行von Kossa和茜素红染色可见大量棕褐色的矿化结节,周边界限不清。体外矿化结节的形成情况能直观地反映细胞的矿化能力，是细胞具备成骨、成牙骨质特性的有力证据[9]。提示在传代过程中hPDLP能够保持矿化能力，并分泌矿化基质。但是对于诱导矿化后的骨基质相关蛋白标志碱性磷酸酶、骨涎蛋白、骨钙蛋白等的表达还有待进一步研究。

PDLSC具有多向分化的能力，具有高度的可塑性，不仅能分化成来源组织的细胞，而且还能转向分化为不同胚层起源的细胞，这是对传统发育生物学观点的革新。本实验参照间充质干细胞的常用诱导方法[4，6]，采用成脂诱导剂对hPDLP分化能力进行研究，表明可定向诱导为脂肪细胞，光镜下可见第1～3代hPDLP细胞中有富集的脂质小泡形成，油红O染色明显可见红染的脂滴，RT-PCR结果也表明有脂肪形成的特异性基因PPARγ2和LPL的转录表达。这与其他学者研究结果相似。而第8代hPDLP经过相同的诱导后虽然也出现了类似的变化，但是形成脂滴的量明显少于第1代的hPDLP，RT-PCR显示在诱导的第8代细胞中不存在相关基因的转录。提示在传代过程中hPDLP中的干细胞成分增殖能力逐渐减弱，并可能丧失其多向分化潜能。

STRO-1和CD146作为早期间充质干细胞标记，广泛应用于间充质干细胞的鉴定[10]。本实验对分离培养的第1～3代hPDLP细胞进行了流式细胞表面抗体检测，结果表明，CD146的阳性率各代之间差异有统计学意义。同时还对hPDLP细胞进行了STRO-1和CD146免疫组化染色。流式检测数据和免疫组化染色结果提示，随着培养时间的延长和细胞代数的增加，牙周膜细胞群中未分化的细胞亚型逐渐减少。研究[11]表明，干细胞在常规培养液中会发生分化，外胚间充质细胞可出现自发分化，主要分化为成肌－成纤维样细胞。

本研究就hPDLP的横向分化能力从矿化和成脂方向进行了研究，结果表明，第1～3代的hPDLP中含有一定比例的干细胞，在体外具有干细胞群的诱导分化能力。hPDLP的体外成功培养鉴定，将为后期研究牙周膜牙骨质复合体的人工生物器官的构建和牙周膜再生治疗提供重要的理论依据。

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（本文编辑 汤亚玲）

Differentiation characteristics of human periodontal ligament cell population in vitro

LIU Juan,ZHAO Hongyu,XUAN Dong-ying,XIE Bao-yi,ZHANG Jin-cai.（Dept.of Periodontology,Guangdong Provincial Stomatological Hospital,Southern Medical University,Guangzhou510280,China）

ObjectiveTo explore the multi-differentiated capability of human periodontal ligament cell population（hPDLP）,and provide a theoretical basis for the periodontal regeneration by tissue engineering technique.MethodshPDLP was cultured from periodontium of human tooth by the outgrowth method.STRO-1 and CD146 expression were investigated by flow cytometry.hPDLP was induced to odontogenic/osteogenic-like and adipogenic-like cell.The multilineage differentiation capacities of hPDLP were evaluated by alizarin red stain,oil red O stain,anti-CD146 and STRO-1 immunocytochemistry,and reverse-transcriptase polymerase chain reaction analysis.Results hPDLP was isolated from human periodontium and most of the cells retained their fibroblastic spindle shape.hPDLP can be induced into osteoblast-like cells and adipocyte-like cells,and calcium deposition and lipid droplets were detected perspectively.And the eighth generation of hPDLP had weaker potential into adipocyte-like cells than the first passage,however,there was no difference to the aspect of calcification ability between the two passages.ConclusionhPDLP culturedin vitrocan differentiate into adipocytes and osteoblasts,and the first to third passage cells may have the predominance of differentiation potential.

human periodontal ligament cell population； differentiation potential； calcification； induction

R 781.4

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2010.02.018

1000－1182（2010）02－0185-05

2009-01-07；

2009-07-05

广东省科技计划项目重大科技专项基金资助项目（2006-B35801010）

刘娟（1980—），女，河南人，硕士

章锦才，Tel：020-84232907