短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂动脉溶栓的实验研究

王宁军 杨维竹 江娜 郑曲彬 黄兢姚 黄宁 申权

短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂动脉溶栓的实验研究

王宁军 杨维竹 江娜 郑曲彬 黄兢姚 黄宁 申权

目的观察短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂不同剂量溶栓的量效关系；对短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂、瑞替普酶、尿激酶溶栓结果进行比较，评价短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂溶栓效果。方法在36只成年毕格犬建立急性脑栓塞模型，随机分为生理盐水组、瑞替普酶组、尿激酶组、短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂大剂量组(75μg/kg)、中剂量组(37.5μg/kg)及小剂量组(18.75μg/kg)6组，分别予以相应干预处理。溶栓后分别于60、120、180、240分钟行颈内动脉造影观察栓塞动脉再通情况并抽取静脉血液测定TT、PT、APTT、FIB及DD。结果（1）溶栓后2小时GBV-PA大剂量组(75μg/kg)、中剂量组(37.5μg/kg)、小剂量组(18.75μg/kg)及生理盐水组血管再通率分别为86.7%、52.4%、33.3%和0.00%，大剂量组血管再通率明显高于中、小剂量组。（2）溶栓后2小时瑞替普酶组、GBV-PA大剂量组、尿激酶组的血管再通率分别为88.9%、86.7%和57.9%，瑞替普酶组、GBV-PA大剂量组均高于尿激酶组，GBV-PA大剂量组和瑞替普酶组两者之间无统计学差异。结论短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂动脉溶栓效果呈剂量依赖性；大剂量短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂比尿激酶具有更强的血栓溶解作用，与瑞替普酶溶栓效果相当。

短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂；瑞替普酶；尿激酶；溶栓；动脉

缺血性脑卒中是严重威胁人类健康的一种疾病，占所有脑血管病患者的60%～80%。溶栓治疗是急性缺血性脑卒中的首选治疗方法。因溶栓药物的选择关系到治疗的成败，故溶栓剂的研究与开发成为近年溶栓研究的热点；其中，开发新型天然溶栓药物是溶栓药物研究的重要方向。在众多的天然溶栓药物中，蛇毒由于含有多种生物活性蛋白质和多肽[1]而备受关注。本实验研究所采用的短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂（plasminogen activator of Gloydius brevicaudus venom，GBV-PA）即是从短尾蝮蛇毒中提取的一种新型的溶栓药物。本实验研究通过比较不同剂量短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂溶栓效果，观察其量效关系；通过对短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂与瑞替普酶、尿激酶动脉溶栓结果进行比较，评估短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂溶栓效果。

1 材料和方法

1.1 犬脑栓塞模型的制作：

1.1.1 自体血栓的制备

抽取毕格犬自体静脉血5ml，常温下4000转/分离心10分钟后取上层血浆1ml加入凝血酶100u混匀并注入尖端缩细的玻璃试管中（缩细部分内径1.5mm），凝固后取出置入生理盐水中反复漂洗，剪成长为5～8mm的血栓条备用。

1.1.2 脑栓塞模型的建立

将犬用3%戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉，仰卧固定后逐层分离、暴露右侧股动脉和左侧股静脉，用改良Seldinger法分别穿刺右股动脉及左股静脉置入4F导管鞘，左股静脉导管鞘用于抽血、补液等用途。经右股动脉鞘先引入4F多功能导管至颈总动脉与颈内动脉分叉处近端，再利用同轴导管技术将3F微导管头端置于颈内动脉起始部上方2～3cm处，行颈内动脉正、侧位造影清楚显示大脑前、中动脉走行情况。用2ml注射器吸入3～5条血栓条经微导管注入颈内动脉，在注入血栓条过程中多次造影证实大脑中动脉栓塞后撤出导管。造影见到以下二种情况之一可认为栓塞成功：1）与栓塞前相比，某支血管走行中断；2）虽未见到明显血管中断，但正位或侧位毛细血管期见到明显的毛细血管网局部缺失。模型建立后，按下述分组进行实验。

1.2 溶栓方法

1.2.1 动物分组及溶栓时间

本实验共选用健康毕格犬36只(雌、雄不限)，体重10～15kg，按上述方法制作脑栓塞模型，并随机分为A、B、C、D、E、F6组：A组为阴性对照组，以0.9%生理盐水行颈内动脉灌注；B组以瑞替普酶行颈内动脉灌注溶栓；C组以尿激酶行颈内动脉灌注溶栓；D、E、F组分别以不同剂量的GBV-PA行颈内动脉灌注溶栓。溶栓后60、120、180、240分钟分别行颈内动脉造影，观察栓塞动脉再通情况。实验结束后以PROLENE线行动、静脉穿刺口吻合。

1.2.2 溶栓剂剂量

本实验分别选用生理盐水（NS）、瑞替普酶（r-PA）、尿激酶(UK)、短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂（GBV-PA）作为溶栓剂：NS剂量为10ml，r-PA溶栓剂量为0.3mg/kg，UK溶栓剂量为6000U/kg，GBV-PA溶栓剂量分别为75μg/kg、37.5μg/kg、18.75μg/kg。所有溶栓剂均溶于50ml生理盐水中，以微注泵泵入，注射速率为0.04ml/s。

1.3 观察指标

1.3.1 DSA脑血管造影

溶栓后行脑血管造影，观察栓塞动脉再通情况，以溶栓后2小时栓塞动脉再通率作为对比指标。血管再通标准：1）完全再通，颅内血管分支显示清楚；2）部分再通，主干和/或部分二、三级分支动脉中断和/或狭窄；3）不通，阻断以下二、三级分支不显影。其中1、2造影表现为再通。

1.3.2 凝血功能

栓塞前，栓塞后即刻、60、120、240分钟抽取静脉血检测凝血酶时间(thrombin time，TT)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time ，APTT)、纤维蛋白原（fibri-nogen，FIB）、D-二聚体(D-dimer，DD)等值。

1.4 统计学分析

使用SPSS12.0统计软件，计量资料采用均数±标准差（），再通率的比较采用Fisher精确概率法，凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原（FIB）、D-二聚体(DD)等指标比较采用t检验，检验水平a＝0.05，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 不同剂量GBV-PA颈内动脉溶栓效果比较

本组观察不同剂量GBV-PA溶栓效果，研究GBV-PA溶栓量效关系。溶栓后120分钟造影，生理盐水组栓塞动脉无再通，GBV-PA各组栓塞动脉均有不同程度的再通（图1、图2、图3）。溶栓后120分钟GBV-PA大、中、小剂量组栓塞动脉的再通率分别为86.7%、52.4%和33.3%（表1），各溶栓组与生理盐水对照组之间再通率均有统计学差异（P＜0.05）；GBVP A大、中、小剂量各组之间的再通率比较亦有统计学差异（P＜0.05），大剂量组血管再通率明显高于中、小剂量组。

对凝血功能的影响：大剂量G B V-P A可使T T、P T、APTT延长，与阴性对照组有统计学差异；中、小剂量GBVPA仅使TT、PT、APTT轻度延长，但与阴性对照组无统计学差异；各组GBV-PA使血液中纤维蛋白原(FIB)含量轻度降低，但与阴性对照组无统计学差异。

本组溶栓结果表明在一定范围内，GBV-PA动脉溶栓效果呈剂量依赖性，即溶栓剂量越大，溶栓效果越好。

2.2 GBV-PA大剂量组、瑞替普酶组、尿激酶组颈内动脉溶栓效果比较

表1 GBV-PA不同剂量组溶栓2h后血管再通情况

表2 不同溶栓剂溶栓2h后血管再通情况

图1 为栓塞前颈内动脉造影像

图2 栓塞后造影见大脑中动脉截断（箭头），远端分支消失。

图3 大剂量GBV-PA动脉溶栓后2h造影 见栓塞之大脑中动脉再通（箭头）。

图4 为栓塞前颈内动脉造影像

图5 栓塞后造影 见大脑中动脉分支之一截断（细箭），远端消失；另一分支近端狭窄（粗箭），远端消失。

图6 瑞替普酶溶栓后2小时造影 见大脑中动脉截断分支（箭头）及狭窄分支均完全再通。

本组比较研究大剂量GBV-PA、瑞替普酶、尿激酶动脉溶栓效果。溶栓后120分钟造影，阴性对照组栓塞动脉无再通，各溶栓剂组栓塞动脉均有不同程度的再通（图4、图5、图6）。溶栓后120分钟瑞替普酶组、GBV-PA大剂量组、尿激酶组各组的血管再通率分别为88.9%、86.7%和57.93%（表2），各溶栓剂组与阴性对照组再通率均有显著差异。瑞替普酶组与GBV-PA大剂量组再通率均高于尿激酶组并有显著差异。再通率GBV-PA大剂量组与瑞替普酶组之间无显著差异（P＞0.05）。

对凝血功能的影响：各组溶栓剂均可使TT、PT、APTT延长，各组之间比较无显著差异（P＞0.05）；尿激酶使血液中纤维蛋白原(FIB)含量明显降低，与阴性对照组有显著差异（P＜0.05）。

本组溶栓比较结果显示大剂量GBV-PA动脉内溶栓效果与瑞替普酶相当，明显优于尿激酶，但副作用小于尿激酶。

3 讨论

溶栓剂的选择是溶栓治疗成败的关键因素。目前常使用的溶栓剂有几个明显的不足：再栓塞、出血副作用和价格昂贵。尿激酶作为目前溶栓最常用的药物[2]，其主要副作用为易引起出血。本组实验中尿激酶组溶栓后凝血功能检测显示尿激酶对凝血系统的影响较明显，除延长凝血酶时间、部分凝血活酶时间外，还显著降低血液中的纤维蛋白原含量。瑞替普酶是第三代溶栓药物的代表，是目前公认的溶栓效果最好的药物。瑞替普酶在溶栓时具有纤维蛋白特异性：即当有纤维蛋白存在时，瑞替普酶与纤溶酶原的亲和力增加600倍左右[3]，故瑞替普酶溶栓效果明显优于尿激酶。但同时有研究表明使用本品成功溶栓后不久，还会发生再栓塞。在对人体的溶栓研究中也存在着类似的问题。本实验结果证明了瑞替普酶具有很强的溶栓作用，但因瑞替普酶价格昂贵[4]，不适合我国国情，现阶段尚难以大规模普及。

由于现有的溶栓剂具有上述不足，因此研制高效低价的溶栓药物仍是一个十分重要的课题[5]。蛇毒制剂由于具有抗凝、溶栓和改善微循环等多种效应，成为国内外溶栓药物研究的重要方向之一。

1993年中科院昆明动物研究所的张云[6]等首先报道了从竹叶青蛇毒中分离、纯化出具有激活纤溶酶原作用的蛋白酶(TSV-PA)，为新型溶栓药物的开发提供了新的思路。此后福建医科大学蛇毒研究所亦从短尾蝮蛇毒中分离纯化出蛇毒纤溶酶原激活剂[7]，研究提示其亦具有溶栓作用。短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂（GBV-PA）属于丝氨酸蛋白酶家族，是一种单链糖蛋白，分子量为40Kda，等电点(isoelectric point，PI)为PH5.2[6]。GBV-PA分子中含有六对二硫键，并由His41、Asp86和Ser180组成催化活性中心，通过专一性地裂解人Glu-纤溶酶原的Arg561-Val562肽键使之变成有活性的纤溶酶，从而发挥其间接溶解纤维蛋白的作用。GBV-PA与组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，t-PA）在结构上具有显著的差异：t-PA分子由F区(finger domain)、EGF区(epidermal growth factor domain)、Kringle1、Kringle2区及蛋白酶区组成。t-PA的分子结构特点决定了其和纤溶酶原都能结合在纤维蛋白表面上[8，9]，故纤维蛋白能够加强t-PA的催化活性。GBV-PA分子缺乏F区、EGF区及Kringle1、Kringle2区，仅含有蛋白酶区。GBV-PA结构的特异性使其具备自身的作用特点：(1)半衰期明显延长 因为F区、EGF区和Kringle1区与肝脏代谢及清除密切相关，GBV-PA缺乏这些区域，不易被肝脏所代谢，所以半衰期较长。本实验中测定GBV-PA经动脉给药消除半衰期约为122min，较t-PA半衰期5min明显延长。半衰期延长可以增加溶栓剂作用时间，增强溶栓效果。(2)GBV-PA不受生理抑制剂的影响，这主要是因为GBV-PA分子的N末端缺乏一系列带正电荷的氨基酸，即Lys-His-Arg-Arg(KHRR)和Arg-Arg-His-Arg(RRHR)序列，而这正好是内源性抑制剂PAI-1(plasminogen activator inhibitor 1)的结合位点，因此GBV-PA对PAI-1不敏感，不易被PAI-1灭活。Bruad S[10]的研究表明，TSV-PA正是由于缺乏KHRR和RRHR序列，因而能逃脱丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用。(3)高度的底物特异性 GBV-PA只专一地作用于纤溶酶原，不能直接降解纤维蛋白原，也不作用于凝血酶原、蛋白C、第X因子等其他的血浆因子[4]，因而对血液凝血系统影响较小。本实验结果GBV-PA中、小剂量组仅使TT、PT、APTT轻度延长，但与阴性对照组无显著差异显示其对凝血系统较小的影响。(4)较小剂量即可发挥其活性作用，此特点是由其高度的底物特异性所决定。福建医科大学蛇毒研究所进一步研究还发现GBV-PA可抑制二磷酸腺苷（ADP）或凝血酶诱导的血小板聚集[11]，这一作用特点对于防止溶栓后栓塞动脉的再狭窄具有重要的意义。本实验研究中，GBV-PA大剂量组溶栓后120分钟栓塞动脉再通率与瑞替普酶组无显著差异，显示了GBV-PA良好的溶栓能力。GBV-PA对血液PT、APTT的延长作用不明显，对血液中纤维蛋白原的减少作用明显小于尿激酶，显示了GBV-PA溶栓过程中较小的副作用。

根据药代动力学定律[12]，蛋白酶类药物在体内按照一级动力学代谢，即药物浓度按恒定比例转运和转化。短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂属于蛋白酶类，其代谢亦应符合一级动力学特点。本实验中GBV-PA大剂量组溶栓后血管再通率高于中剂量组，中剂量组又高于小剂量组。上述结果说明GBV-PA动脉溶栓效果呈剂量依赖性：在一定范围内，给药剂量越大，溶栓效果越好。

通过以上实验，可以得出结论：GBV-PA动脉溶栓效果呈剂量依赖性；GBV-PA(75μg/kg)与瑞替普酶（0.3mg/kg）溶栓效果相当，比尿激酶(6000U/kg)具有更强的溶栓作用，但副作用较尿激酶为小；

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Experimental study of thrombolysis in artery by plasminogen activator of Gloydius brevicaudus venom(GBV-PA)

WANG Ning-jun, YANG Wei-zhu, JIANG-Na, ZHENG Qu-bin, HUANG Jing-yao, HUANG-Ning, SHEN-Quan
Department of Medical Imaging,Beijing Jingmei Group General Hospital,Beijing,102300,China;
Department of Interventional Radiology, Affiliated Union Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350001,China

Objective To observe the relationship between thrombolytic effect and doses of plasminogen activator of Gloydius brevicaudus venom (GBV-PA); To evaluate the intraarterial thrombolytic effect of plasminogen activator of Gloydius brevicaudus venom(GBV-PA) compared with reteplase(r-PA) and urokinase(UK). Methods The model of acute left cerebral embolism was established with interventional technique in 36 adult beagle dogs,which were randomly divided into 6 groups,including control group,reteplase group, urokinase group, GBV-PA high-dose group(75μg/kg),middle-dose group (37.5μg/kg) and low-dose group(18.75μg/kg). Each group was dealt with by correspongding thrombolyticsrespectively.Angiography of left internal carotid artery were performed after thrombolysis 60,120,180,240 minutes to observe the recanalization of embolized arteries.Blood samples were collected to determine thrombin time (TT), prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time(APTT),fibrinogen(FIB)and D-Dimer(DD). Results (1)The recanalization rate after thrombolysis 2 hours was 86.7% in GBV-PA high-dose group,52.4% in GBV-PA middle-dose group, 33.3% in GBV-PA low-dose group and 0.00% in control group. There was significant statistical difference between every two-groups. (2)The recanalization rate after thrombolysis 2 hours was 88.9% in reteplase group, 86.7% in GBV-PA highdose group and 57.9% in urokinase group. The vascular recanalization rate in GBV-PA high-dose group and reteplase group was higher than that in urokinase group. There was no significant statistical difference in vascular recanalization rate between GBV-PA high-dose group and reteplase group. Conclusion The thrombolytic effect of GBV-PA was dose-dependent;The thrombolytic power of high-dose GBV-PA was stronger than that of urokinase.But there was no significant difference in vascular recanalization rate between high-dose GBV-PA and reteplase.

plasminogen activator of Gloydius Brevicaudus venom; urokinase; reteplase; thrombolysis; artery

10.3969/j.issn.1009-4393.2010.11.031

北京 102300 北京京煤集团总医院影像科（王宁军）福建 350001 福建医科大学附属协和医院介入科（杨维竹 江娜 郑曲彬黄兢姚 黄宁 申权）

杨维竹 E-mail：ywzjn@sina.com