纤维调节素在人类牙周细胞损伤愈合中的免疫组织化学表达

钱虹 黄群 肖殷

（1.广东省口腔医院·南方医科大学附属口腔医院 儿童牙科，广东 广州 510280；

2.广东省妇幼保健院 口腔中心，广东 广州 510010；3.昆士兰理工大学，澳大利亚 布里斯班 4000）

纤维调节素在人类牙周细胞损伤愈合中的免疫组织化学表达

钱虹1黄群2肖殷3

（1.广东省口腔医院·南方医科大学附属口腔医院 儿童牙科，广东 广州 510280；

2.广东省妇幼保健院 口腔中心，广东 广州 510010；3.昆士兰理工大学，澳大利亚 布里斯班 4000）

目的 研究纤维调节素在牙周细胞损伤愈合中的表达，探讨纤维调节素在牙周损伤愈合中的作用。方法培养人类牙周细胞（牙龈成纤维细胞、牙周膜成纤维细胞和成骨细胞）；在培养了牙周细胞的载玻片上做损伤细胞的圆形创口，建立牙周细胞损伤模型，跟踪观察7 d；用免疫组织化学染色的方法，观察纤维调节素在牙周细胞损伤愈合过程中的表达。结果 牙周细胞损伤后第1天，纤维调节素较强表达于损伤边缘新移行的细胞；随后，纤维调节素对损伤区新近移行的细胞的表达强于创口周围的细胞。结论 纤维调节素强烈表达于损伤区新近移行的牙周细胞，可能参与牙周损伤愈合的早期活动。

纤维调节素； 牙周细胞； 损伤愈合； 免疫组织化学

牙周损伤愈合是一个复杂的过程，包括细胞和细胞外基质之间在时间上和空间上的协调活动，而这些活动涉及上皮和牙龈、牙周膜、牙骨质和骨等结缔组织，对损伤愈合区域细胞及组织的变化起决定性作用。牙周组织再生需要牙周组织中的细胞移行、增殖和分化，因而在牙周再生过程中，牙周细胞显得非常重要。在牙周损伤部位的细胞类型将会影响愈合结果，牙周损伤区细胞数目的调节也被认为是牙周组织再生的关键。因此，了解牙周损伤愈合的重点是了解损伤区细胞移行和增殖的调节。

利用体内牙周损伤愈合模型进行损伤愈合的免疫组织化学研究[1-3]的结果显示，细胞外基质蛋白多糖中的纤维调节素与牙周损伤愈合有着密切的关系，很可能参与牙周损伤愈合早期的组织活动。为了进一步证实纤维调节素与牙周损伤愈合早期阶段有关，本研究设计了体外牙周细胞损伤愈合模型，目的是揭示纤维调节素在牙周细胞损伤愈合期间细胞中的免疫组织化学表达。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人类牙龈成纤维细胞、牙周膜成纤维细胞和成骨细胞取自澳大利亚昆士兰大学牙学院结缔组织研究实验室。这些细胞从人类正常牙龈、牙周膜和牙槽骨组织中分离出来，保存于液氮中。使用时，从液氮中取出细胞，培养在DMEM培养基中，并加入10%胎牛血清、每毫升50单位青霉素、每毫升50单位链霉素以及10%非必需氨基酸。这些细胞孵育在37℃，含5%二氧化碳和95%空气的湿润环境中。培养基每2～3 d更换1次。实验所用细胞为第4代到第8代。

1.2 牙周细胞损伤模型

细胞损伤操作步骤如下：1）当培养的牙龈成纤维细胞、牙周膜成纤维细胞和成骨细胞充满培养基时，将它们转移到组织培养载玻片上（每毫升105个细胞），继续培养；2）约1周后，细胞充满整个载玻片；3）将经过消毒的圆柱状橡皮置于载玻片上，轻压并旋转，产生约6mm直径的圆形创口，借助倒置显微镜检查损伤区是否干净，无细胞残存；4）创口区用PBS轻轻冲洗；5）置于新鲜培养基中继续培养。

1.3 免疫组织化学

在牙龈成纤维细胞、牙周膜成纤维细胞和成骨细胞损伤后第1、3、7天，取出载玻片，采用ABC法常规免疫组织化学染色。一抗选用多克隆抗纤维调节素抗体（1∶1 000）；用光学显微镜观察切片染色情况，并记录实验结果。

2 结果

抗纤维调节素的多克隆抗体用于体外损伤牙周细胞的免疫组织化学染色，观察种在载玻片上的牙龈成纤维细胞、牙周膜成纤维细胞和成骨细胞损伤后纤维调节素的表达。在牙周细胞损伤后第1天，创口边缘向损伤区移行的牙龈成纤维细胞较强表达纤维调节素，损伤区周围的纤维调节素表达略弱。在牙周细胞损伤后第3天，新近移行到损伤区的细胞都比损伤区周围的细胞有更强的纤维调节素表达（图1左）。损伤后第7天，一些细胞已经到达损伤区域的中心，原来缺损细胞的损伤区逐渐被细胞充满。在损伤区中心的细胞对纤维调节素的着色极强，而周围的大多数细胞表达略弱（图1中、1右）。纤维调节素在牙周膜成纤维细胞和成骨细胞的损伤愈合中也呈现与牙龈成纤维细胞中类似的表达。

图1 纤维调节素在牙龈成纤维细胞损伤愈合中的表达 ABC ×200Fig 1 Expression of fibromodulin in gingival fibroblasts during wound healing ABC ×200

3 讨论

牙周损伤愈合是一个极其复杂的过程，涉及至少4种不同的结缔组织，包括牙龈、牙周膜、骨和牙骨质。在组织再生时，必然发生特定细胞向损伤区移行、细胞增殖、新的细胞外基质充填缺损的组织等过程。牙周损伤愈合过程中的主要活动包括以下过程：损伤形成；大量生长因子和细胞因子出现；细胞因子和炎性因子诱导成纤维细胞移行和增殖；新的基质合成。

损伤的产生是导致再生的系列活动中的一个基本步骤[4]。培养细胞的机械损伤模型有几种[5-7]，本研究采用的损伤模型是Klein-Soyer等[8]设计的损伤模型的改良型。该模型的优点是：可以做出一致的圆盘形损伤区，这种损伤的范围能使细胞培养相对较长的时间而不至于损伤后迅速愈合，因此有利于观察细胞的增殖、移行。在其他模型系统（如反复刮擦系统）中，细胞移行太快，损伤在非常短的时间内修复，很难用于定性、定量评估[9]。Lacker等设计的模型虽然没有上述缺陷，但他们使用损伤工具做出的长条形损伤区，只能控制损伤区的宽度，很难使损伤区长度达到一致。

据研究，来自牙周膜的祖代细胞向损伤区移行、增殖和分化，最终形成牙周组织。而在损伤区，这种祖代细胞的选择性聚居被认为是导致牙周再生的关键[10]。从临床水平来看，采用排除牙龈成纤维细胞的技术有助于牙周膜细胞聚居。如果不排除牙龈成纤维细胞，损伤区域的结缔组织和上皮附着将会占据牙周再生的主要活动，从而影响牙周组织的再生。由此可见，本研究采用的体外损伤模型有利于帮助更好地理解和调节与牙周损伤愈合相关的复杂活动。

在损伤愈合的早期阶段，蛋白多糖生产的重要性是不容忽视的。体内实验性损伤愈合模型显示，蛋白多糖的合成比胶原合成早几天。新形成的细胞外基质是细胞移行的重要调节者。病灶黏附区蛋白多糖的数量分析结果也证实了蛋白多糖在早期细胞移动中起作用[11]。

纤维调节素作为细胞外基质蛋白多糖的一个成员在损伤愈合中有表达。在大鼠的皮肤损伤愈合模型中，成年鼠损伤愈合的早期，缺少纤维调节素的表达，导致瘢痕和纤维化形成；而在胚胎鼠损伤愈合模型中，纤维调节素的早期表达较明显，最终导致无瘢痕愈合[12]。纤维调节素在人类肉芽组织的成纤维细胞中的表达明显提高，提示这种蛋白多糖可能在牙周慢性炎症和损伤愈合中起作用。

在体内实验的免疫组织化学研究中，本实验观察到纤维调节素在牙周损伤愈合的初期，强烈表达于移行的牙龈上皮细胞和肉芽组织，随着愈合过程的进行，纤维调节素在牙周组织中的表达略有减弱，推测纤维调节素与牙周损伤愈合的早期阶段有关[2]。从体外实验免疫组织化学的研究结果来看，纤维调节素对新近向牙周细胞损伤区移行的牙龈成纤维细胞、牙周膜成纤维细胞和成骨细胞有强烈的表达，损伤区周围的细胞则表达稍弱。该结果进一步证实了纤维调节素在牙周损伤愈合早期阶段起作用。

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（本文编辑 汤亚玲）

Immunohistochem ical presentation of fibromodulin during wound healing of periodontal cells

QIAN Hong1,HUANG Qun2,XIAO Yin3.（1.Dept.of Pediatric Dentistry,Guangdong Provincial Stomatological Hospital,Stomatological Hospital Affiliated to Southern Medical University,Guangzhou510280,China;2.Stomatological Center, Guangdong Provincial Women and Children′s Hospital,Guangzhou510010,China;3.Queesland University of Technology,Brisbane4000,Australia）

ObjectiveTo investigate immunohistochemical presentation of fibromodulinin vitroduring wound healing of three types of periodontal cells and discuss the role of fibromodulin.MethodsCultured periodontal cells were wounded and followed by observation up to 7 days.The immunohistochemical expression of fibromodulin in periodontal cells was observed.Results Immunohistochemical localization of fibromodulin during cellular wound healing showed that newly migrating periodontal cells toward the wound area were expressed strongly for fibromodulin at day 1 after wounding;thereafter,fibromodulin expression was noted stronger in newly migrating periodontal cells localized in the central part of the wound area than those around the wound area.ConclusionThese data suggest that fibromodulin may be involved in the early events of wound healing for periodontal cells.

fibromodulin； periodontal cells； wound healing； immunohistochemistry

R 781

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2010.02.023

1000－1182（2010）02－0208-03

2009-03-15；

2009-09-22

教育部留学回国人员科研启动基金资助项目[教外司留（2005）383号]

钱虹（1968—），女，湖北人，主任医师，博士

钱虹，Tel：020-84406578