城市污泥堆肥过程中纤维素降解菌的筛选及鉴定

崔丽娟，申雪庆，周东兴

（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030）

纤维素是地球上最丰富、数量最大的可再生资源[1]，占全球植物总干重的30%～50%[2-3]。据不完全统计，全世界每年因废弃物焚烧造成的直接经济损失达数十亿元，利用率低（10%左右）[4-7]。目前，在利用生物学方法来处理废弃物方面，主要存在的问题是缺少高效分解木质纤维素类物质的微生物及其发酵工艺[8]，受成本的限制。近年来，生物学方法利用纤维素类固体降解废弃物取得了一定的突破[9]，具有很好的应用前景。

在纤维素分解菌的筛选及性状研究方面，国内外相关报道很多，种类从真菌，放线菌到细菌均有所涉及[10-11]。Peter等曾列举总结出一系列的纤维素分解菌，大部分都是厌氧菌，其中只有3种是好氧菌[12]。利用微生物发酵堆肥方法是处理城市污泥的途径之一。通过微生物的分解作用，可以把城市污泥和作物秸秆等转化为优质的有机肥。城市污泥是一种可以再利用的有机固体废弃物，其物理特性为絮状体结构，脱水性差，分散困难[13-14]，不利于好氧发酵的顺利进行，需要添加碳源（如稻壳、秸秆等），同时可增加发酵物料的孔隙度。目前在如何快速降解城市污泥和农业废弃物发酵过程中纤维素的应用和作用研究方面，报道较少[15-16]。

本研究旨在在城市污泥和稻壳混合物料发酵过程的升温阶段筛选出高效纤维素降解菌，为污泥堆肥的生物处理提供原始菌株。

1 材料与方法

1.1 供试材料

哈尔滨文昌污水处理厂的脱水污泥，进行好氧发酵，在发酵的升温阶段进行取样。好氧发酵设备为自行研制的卧式旋转式污泥好氧发酵装置。

1.2 培养基

①纤维素刚果红培养基参见文献[17-18]；②赫奇逊培养液，内放滤纸条（1 cm×6 cm）；③羧甲基纤维素培养基；④PDA培养基；⑤液体发酵培养基:水解酪素0.5 g，蔗糖15.0 g，酒石酸铵5.0 g，NH4NO31.0 g，KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，CaCl20.1 g，蒸馏水1000mL。

1.3 菌种分离

样品用无菌水作梯度稀释，室温160 r·min-1振荡30 min。取10-9稀释度的菌悬液涂布于纤维素刚果红培养基初筛，置于37℃恒温恒湿培养箱中培养，挑取生长快、红色浓郁且透明圈大的培养物，以滤纸为唯一碳源的赫奇逊培养液进行复筛，将滤纸分解速度快的培养物挑选出来，在羧甲基纤维素培养基上反复划线直至得到纯菌株，以此作为目标菌。另接种PDA斜面保存。

1.4 菌株的生长速率测定

挑选出的菌株接种于刚果红平板培养基中央，置于37℃下恒温恒湿条件下培养6 d，每天测定水解圈直径的大小，计算水解圈直径与天数的比值，以cm·d-1表示平均生长率。

1.5 菌株对纤维素降解能力测定

将生长速度快及水解圈大的菌株接种于赫奇逊培养液中，以不接种处理作对照，37℃、120 r·min-1摇床培养 10 d，分别在第 3、5、7、10天时测定其滤纸失重率。方法为用滤纸过滤发酵液，将残留物80℃烘干称重，用减重法计算出滤纸失重率。

1.6 菌种鉴定

1.6.1 形态观察及鉴定

将目标菌接种至PDA斜面，37℃倒置培养72 h，观察菌落形态，正反面颜色。真菌鉴定主要依据文献[19-20]，以菌落特征和形态学特征为主。形态特征以菌丝体的形状为主。经处理后用扫描电子显微镜观察。

1.6.2 rDNA-ITS序列的PCR扩增、序列分析及系统发育树的构建

该方法不仅用于分类鉴定，还可对菌种类群作系统发育分析[21]。液氮研磨液体发酵后的菌丝球，提取基因组DNA[22]，采用真菌通用引物扩增内转录间隔区的保守序列，正向引物:5′TCCGTAGGTG AACCGTCGG 3′，反 向 引 物 : 5′TCCTCCGCTTA TTGATATGC 3′；PCR反应条件:94℃预变性5 min，94℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸10 min，4℃冷却中止反应。琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物的测序由大连宝生物工程有限公司完成，所得序列通过Blast程序与GenBank中的核酸数据进行比对分析。用MEGA4.0软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 菌株的生长速率

将复筛得到的菌株接种于刚果红纤维素琼脂平板，测定透明圈直径，与天数的比值表示其生长速率，该比值可说明产纤维素酶量的高低或酶活性的强弱。测定结果见表1，该比值可大致说明产纤维素酶量的高低或酶活性的强弱。通过对比值大小进行比较，可以判断各不同的菌株间降解纤维素能力的差异。分析结果为C、B、E生长速率较快。对初筛与复筛的结果进行综合分析，判断B、E菌株为目标菌种。

2.2 菌株对纤维素的降解能力

对照为未添加菌株的赫奇逊培养液，在30℃摇床培养10 d后无任何变化。对5个菌株进行滤纸失重试验得出结论:菌株B和E对底物滤纸的降解率最高，分别为53%和39%。结果见表2。

2.3 形态特征

筛选出来的5种菌株的菌落形态特征见表3。

表1 菌株在刚果红纤维素琼脂平板上的生长情况Table1 Growth of the strains on cellulose-congo red medium

表2 不同培养时间的滤纸失重率Table2 Ratio of weight losing of filter paper in different time （%）

表3 菌株的菌落形态观察Table3 Colony morphological characteristics of strain

电镜图片及PDA斜面生长情况见图1～5。由图1～5可见，各菌株的形态特征A:丝状菌丝体，易挑取，正反面颜色不一致，形成孢子囊，产生子囊孢子，菌丝有横隔，孢子繁殖；B:白色菌落，絮状，致密、扁平、干燥、不易挑取、生长迅速，正反面颜色一致，不形成孢子，以菌丝断裂方式繁殖，菌丝表面有刺状突起，有横隔，菌丝直径5μm；C:生长缓慢，初期白色菌落，后期形成有颜色的孢子，孢子直径20μm，此为放线菌菌落特征；D:菌丝疏松，绿色，正反面颜色一致，孢子纺缍形，表面不光滑；E:菌丝体橙黄色，丝状，生长迅速，无分枝，孢子表面有皱纹，近球形。孢子直径40μm，菌丝直径70μm，有横隔，极易挑取。

图 1 A菌株的扫描电镜图(×8500，×2000)Fig.1 A by scanning electron-microscope

图 2 B菌株的扫描电镜图(×8500，×2000)Fig.2 B by scanning electron-microscope

图 3 C菌株的扫描电镜图(×8500，×2000)Fig.3 C by scanning electron-microscope

图 4 D菌株的扫描电镜图(×8500，×2000)Fig.4 D by scanning electron-microscope

图 5 E 菌株的扫描电镜图（×1000，×2000）Fig.5 E by scanning electron-microscope

2.4 菌株B和E的形态学鉴定

对筛选出的5个菌株，针对降解纤维素效果较好的菌株B和菌株E进行了形态学鉴定。根据菌落形态及菌体特征判断，菌株B和E为两株真菌。对两株真菌进行rDNA-ITS序列解析（测序结果略），分别获得GenBank登录号FJ824032和FJ824033。系统进化树重建结果及鉴定结论

将所测得序列在NCBI数据库中进行相似性搜索（BLAST），选取其中已经发表的，相似性较高的序列，与B和E的菌株序列以邻接法构建系统进化树，所用程序为MEGA4，分析进行1000次重复。

采用通用引物IST1和ITS4，对菌株的基因DNA扩增获得了片段大小为505bp的ITS片段，对上述PCR扩增产物进行序列测定，该菌株的保守序列在NCBI网站上进行同源性比较，发现与尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的高度相似，相似性达到100%。说明两者有特别近的亲缘关系。菌株B获得GenBank登录号为FJ824032（见图6）。

采用通用引物IST1和ITS4，对菌株的基因DNA扩增获得了片段大小为549bp的ITS片段，对上述PCR扩增产物进行序列测定，该菌株的保守序列在NCBI网站上进行同源性比较（BLAST），发现该菌株的保守序列与脉孢菌（Neurospora sp.）高度相似，达到99%以上，认为两者有特别近的亲缘关系。菌株E获得GenBank登录号为FJ824033（见图 7）。

图6 菌株B基于rDNA-ITS区序列重建的系统进化树Fig.6 Phylogeng tree of B based on rDNA-ITS sequence

图7 菌株E基于rDNA-ITS区序列重建的系统进化树Fig.7 Phylogeng tree of E based on rDNA-ITS sequence

3 讨论与结论

纤维素是地球上非常丰富的可再生性资源，如农业生产中产生的秸秆，以及城市污泥当中存在的，若将这些物质充分利用好，则每年能够在很大程度上降低化学肥料的施用量，实现节能减排。但目前主要存在的问题是缺少高效分解木质纤维素类物质的微生物。本研究在好氧发酵过程中筛选出5株纤维素分解菌，对其中两株降解能力强的菌株通过形态特征观察、rDNA-ITS序列分析结果表明两菌株分别为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和脉孢菌（Neurospora sp.），在赫奇逊培养液中培养10 d后滤纸失重率分别达到53%和39%。本试验利用城市污泥和稻壳做为添加剂和调理剂，对纤维素分解菌进行筛选，促进城市和农村废弃物的分解和利用，在理论和应用当中具有很重要的实践意义。

目前，国内外应用较多的是EM菌，该制剂是由80多种微生物复合而成的，应用领域广，效果较好，利用了多菌株的协同作用。本研究只筛选出了两株效果较好的微生物菌株，其实际应用效果需要在今后的进一步试验中验证。本试验过程中使用的自制的卧式旋转式污泥好氧发酵装置，通过试验表明，该设备在物料翻转周期和通风控制上还存在一定问题，需进一步改进，配合筛选出的好氧发酵微生物实现更好的废弃物处理效果。

rDNA-ITS鉴定是一种很精确的鉴定手段，使我们能够准确认识筛选出来的微生物种类，为今后的实际生产和产业化目标奠定基础。下一步研究工作将针对高效分解微生物的进一步筛选和复配，以及实际应用效果研究方面展开。

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