污染土壤中耐镉菌株的筛选、鉴定及吸附试验研究

耿印印，王旭梅,*，王红旗，佟秀春

（1.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030；2.北京师范大学水科学研究院，北京 100875）

镉是一种比较稀有的金属，它极易蓄积在土壤中。在目前的重金属污染中，镉污染很突出，是面积最广、危害最大的重金属元素之一。有资料显示，我国受镉污染的耕地面积约1.33万hm2。镉对作物和蔬菜会产生毒害作用，并最终在植物可食部分积累而污染农产品，而且可通过食物链进入人体。当其超过一定限量时，会对生态环境和人体造成危害。

目前，现有的镉污染土壤修复方法普遍存在着二次污染、成本高、修复效果不理想等问题。而生物修复技术是最近30年来全球极力研究开发的一种绿色、经济的环境修复方法，其在治理土壤污染方面的作用越来越受到广泛的关注。主要包括两大类:植物修复技术和微生物修复技术。

镉污染土壤的微生物修复是利用微生物的生物活性对重金属的亲合吸附或转化为低毒产物，从而降低重金属的污染程度。在长期受某种重金属污染的土壤中，生存着很大数量的、能适应重金属污染环境并能氧化或还原重金属的微生物类群。一些微生物如细菌、真菌和藻类等对重金属离子都有很强的耐受性及吸附能力。本文着重研究从镉污染的土壤中分离驯化耐镉菌株，并进行吸附试验研究，进一步选出两株吸附效果最好的菌株，以期为土壤的镉污染修复提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样

土样1:采自北京市某工厂车间土；

土样2:采自北京市某工厂边缘的土；

土样1中镉含量为2.13 mg·kg-1，土样2中镉含量为1.23 mg·kg-1，都超过了国家土壤环境质量的三级标准值。具体的理化性质见表1。

表1 土样的理化性质Table1 Soil physical and chemical properties

1.1.2 培养基

无机盐培养基:Na2SO42 g，K2HPO46 g，KH2PO45.5 g，KCl 2 g，MgSO47H2O 0.2 g，微量元素 1mL，去离子水定容至1 L，调节pH为7。

牛肉膏蛋白胨液体培养基:牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去离子水定容至1 L，调节pH为 7.2～7.4。

牛肉膏蛋白胨固体培养基:同牛肉膏蛋白胨液体培养基，加琼脂1.5%～2.0%。

1.2 方法

1.2.1 土样的采集

采用五点法，取地下5～10 cm的土壤样品混合，无菌袋带回实验室，风干，研磨过筛，放-20℃冰箱里备用。

1.2.2 菌株的分离、驯化

分别称取两种风干污染土1 g，放入盛有100mL无菌水并带有玻璃珠的250mL的三角瓶中，28℃摇床振荡30 min，使土样与无菌水充分混合。取10mL菌液加入到90mL无机盐培养基中，再摇床振荡培养5 d。静置后取10mL培养液逐步转接于Cd2+浓度分别为10、20、30、40、60 mg·L-1无机盐培养基中，加入葡萄糖为碳源、硝酸钾为氮源。28℃摇床振荡，每次培养7 d，进行驯化。

1.2.3 菌株的纯培养

把稀释10-5倍的菌液涂布于牛肉膏固体培养基平板，培养一段时间后形成单菌落。挑选长势好、菌落饱满的菌株用连续划线法对细菌纯化培养。

1.2.4 菌株的鉴定

以各单菌液为PCR的反应模板，实验采用的PCR反应引物为16S rDNA细菌通用引物27F（正向引物）、1492R（反向引物）。

PCR扩增反应体系为聚合酶 50μL:2×TaqPCRmasterMix 25μL（0.1 U·μL-1Taq 聚合酶；500μmol·L-1dNTP；20 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.3）；100 mmol·L-1KCl；3 mmol·L-1MgCl2），引物 27F（20 mmol·L-1）2μL，引 物 1492R（20μmol·L-1）2μL，模板 2μL，超纯水 19μL。

PCR扩增反应条件:94℃预变性6 min，94℃变性30 s，52℃复性40 s，72℃延伸1.5 min，进行30个循环，最后72℃延伸10 min。

5μL PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测（90 V，30 min），用凝胶成像系统观察结果并拍照。扩增产物回收纯化后测序，并将测序结果在NCBI网站上用Blast进行核苷酸同源性比较，初步鉴定其种属。

1.2.5 菌株对镉的吸附试验

研究所筛选菌株对镉的吸附能力，通过与污染土中土著微生物的吸附能力比较，选出吸附效果最好的菌株。

选用土样1做吸附试验。在无菌条件下将所筛选菌株分别接种于牛肉膏液体培养基中，振荡富集培养3 d，然后离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液多次洗涤，最后用无菌水配制成菌液。

取风干并过筛的土样3 g于100mL三角瓶中，分别加入菌液30mL，并用无菌水作对照，让其在28℃下放置（培养）。15 d后把土样自然风干并研磨。

称取0.1～0.3 g土样，以HNO3为消解液，用微波消解仪进行消解处理，然后用电感耦合等离子光谱仪测定土样中镉的含量。对照空白，计算吸附率。吸附率（%）＝（C0－C）/C0×100%。

1.2.6 菌株对铅的吸附试验

在土壤的重金属污染中，镉和铅常常伴随存在，为此对分离出的耐镉菌株进行对铅的吸附能力研究。

原状污染土样1中铅的含量为168 mg·kg-1。方法同对镉的吸附试验，计算吸附率。

1.2.7 pH和温度对菌株生长的影响试验

设定不同的pH和温度对所筛选的耐镉菌株进行培养，观察对菌生长量的影响。设pH分别为3、5、7、9、11；温度分别为 10、20、25、30、40℃。确定菌的最佳生长温度和pH值，然后再进行培养，以培养时间为横坐标，以OD600值为纵坐标，绘制菌的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离、驯化及纯培养

通过每次转接前对菌液进行涂布发现:随着镉浓度的增加，菌落的数量明显减少。Cd2+浓度为60 mg·L-1时，选择合适的稀释浓度10-7涂布的培养基平板，对生长较好的细菌进行分离纯化，得到14株形态各异的耐镉细菌，其中从车间土中筛选出13株，分别标记为Z1～Z13，工厂边缘的土中筛选出1株，标记为B1。划线纯化的菌形态如图1所示。

图1 菌株在培养基上的菌落形态Fig.1 Colonial morphology of strains on medium

2.2 菌株的鉴定

细菌的16S rDNA基因，在分子进化中非常保守，在一定程度上反映细菌的系统发生，因此，16S rDNA序列可用于微生物的鉴定及其分类地位的确定。以菌液为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1500bp的扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物由北京三博远志生物公司测序完成，得到的14株菌的基因序列在NCBI网站上用Blast进行同源比对，查询结果如表2所示。

表2 在GenBank中比对所得最大相似度菌株Table2 Cultured bacteria and their most closely matched species in GenBank

根据比对结果，计算每种属所占的比例，得出所采污染土样中对镉有较强耐性的各细菌种属所占比例如图3所示，其中72%为铜绿假单胞菌，可知铜绿假单胞菌对镉有较强的耐受性，属于优势菌群。

图2 土样中微生物的组成Fig.2 Microbial community structure of soil sample

2.3 镉和铅的吸附试验

测定土样中镉和铅的含量，计算吸附率，结果如表3所示。

式中:C0-吸附前土样中Cd2+/Pb2+的含量（mg·kg-）1；

C-吸附后土样中 Cd2+/Pb2+的含量（mg·kg-1）。

由表3可知，与土样中土著微生物相比，所筛选驯化出的14株菌对镉和铅都有一定的吸附效果，5、7、11、13号菌对镉的吸附率比较高，都超过了40%，其Z13号菌对镉的吸附率最高，达到47%，而Z11号菌对铅的吸附率最高，也达到了47%。由于土壤中的重金属污染，镉和铅常常伴随存在，所以11和13号菌对镉和铅复合污染土壤的修复更具有实用价值。对这两株进行生物学特性研究。

表3 菌株对镉和铅的吸附结果Table3 Results of adsorption of Cd2+and Pb2+by strains

2.4 pH和温度对菌株生长的影响

2.4.1 温度对菌株生长的影响

结果见图3。

图3 温度对菌Z11和Z13生长的影响Fig.3 Effect of temperature on growth of strain Z11 and Z13

如图3所示，随着培养温度的升高，Z11和Z13生长量逐渐增大，在20～25℃下生长量达到最大值，继续提高温度，生长量逐渐下降，说明两菌株都不能耐高温。

2.4.2 pH对菌株生长的影响

结果见图4。

图4 pH对菌株Z11、Z13生长的影响Fig.4 Effect of pH on growth of strain Z11 and Z13

如图4所示，Z11菌能够在pH值为5～9范围内生长，对外界酸碱性的变化具有较强的耐受性，最适生长pH为7～9；Z13菌最适生长pH为5～7，在碱性条件下几乎不能生存，在偏酸环境下，生长良好。两株菌在pH为7时生长都较好。

2.4.3 最佳生长条件下菌的生长曲线

在最佳生长温度25℃，pH 7时培养菌，用722分光光度计比色法（波长为600nm）测定不同培养时间（3、6、9、12、18、24、30、38、48、60、72 h）细菌悬浮液的OD600值。生长曲线见图5。

由图5可知，菌株Z11在培养6 h后进入生长对数期，在30 h后进入稳定期，在38 h时达到生长最高峰，48 h后进入衰亡期；Z13是培养9 h后进入生长对数期，在30 h时达到生长高峰期，随后进入稳定期，60 h后进入衰亡期，同一时刻测定的OD600值总体反映出菌株Z13的生物量高于菌株Z11。

图5 菌株Z11、Z13的生长曲线Fig.5 Growth curve of strains Z11 and Z13

3 讨论

a.镉不仅是微生物生长代谢过程中的必需元素，而且是毒性非常大的重金属，微量的镉都会对微生物产生毒害，但在受镉污染的土壤中，微生物由于长期遭受重金属的胁迫，具有了抵抗毒害的能力。为了进一步获得对镉有较高耐性的微生物，本试验通过驯化培养，逐步提高重金属离子的浓度，以提高微生物对重金属的耐受性，经多代传种而获得目的菌株。最后从镉含量超标的样土中共筛选驯化出14株耐镉的细菌。

b.通过与污染土中土著微生物的吸附能力比较，研究所筛选菌株对镉的吸附能力。由结果可知与土样中土著微生物相比，所筛选驯化出的14株菌对镉都有一定的吸附效果，其中Z13号菌对镉的吸附率最高，达到47%。

菌株最终要应用于土壤重金属污染的治理，而在现实土壤的重金属污染中，镉和铅常常伴随存在，为此对分离出的耐镉细菌进行对铅的吸附能力研究。结果表明14株耐镉细菌对铅也有一定的吸附效果，其Z11号菌对铅的吸附率最高，达到了47%。Z11和Z13菌对重金属污染土壤的修复更具有实用价值。

从生物吸附角度看，细菌对金属离子的吸附不仅与细胞活性、表面结构、组成及细胞的新陈代谢过程有关，还有多数研究认为细菌对镉的耐性与质粒存在有关，有关耐镉细菌细胞吸附镉的机理还有待进一步论证。

c.通过吸附试验研究，最终选定菌株Z11和Z13进行后续强化龙葵吸收重金属镉的试验。所以本试验只研究了这两株菌的生长环境因素。结果表明两株菌都不能耐高温。由于土壤中温度变化不大，所以对菌株的实际应用没有影响。菌Z11对外界酸碱性的变化具有较强的耐受性，而菌Z13在偏酸的条件下生长较好。菌株对环境和土壤条件的适应性越强其应用价值越高。

4 结论

本试验从镉含量超标的样土中共驯化出14株耐镉的菌株。经过16S rDNA序列分析，初步鉴定出种属，分析菌群结构，可知铜绿假单胞菌占72%，属于优势菌群。同时对耐镉菌株分别进行镉和铅的吸附试验研究，选取吸附镉和铅效果最好的两株菌，菌Z11对镉和铅的吸附率分别达到40%和47%，菌Z13是47%和33%。对两株菌进行生物学特性研究可知，它们在20～25℃下生长量达到最大值，都不能耐高温。Z11最适生长pH为7～9，Z13菌最适生长pH值为5～7，Z11对外界酸碱性的变化具有较强的耐受性，Z13在偏酸的条件下生长较好。在最佳生长条件温度为25℃，pH为7时绘制出两株菌的生长曲线，同一时刻测定的OD600值总体反映出菌株Z13的生物量高于菌株Z11。本研究为镉污染土壤的微生物修复提供一定的试验基础和理论依据。

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