Cramp转基因小鼠的构建及鉴定

石桂英，全雄志，陈显达，陈陟阳，董 伟，张连峰，鞠振宇

（中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，北京 100021）

Cramp（cathelin-related antimicrobial peptide）基因，位于9号染色体，其编码蛋白为cathelin-related antimicrobial peptide，即cathelicidin。该类蛋白是在哺乳动物体内发现的一类结构多变的抗微生物肽，因在表达的信号肽与成熟肽之间含有一高度保守的cathelin肽段而自成一家族［1］。Cathelicidin是宿主免疫防御系统的重要组成部分。目前已知其主要功能是抗菌活性，此外，还具有抑制组织损伤、促进创伤修复、结合内毒素、诱导血管生成等多种生物学功能。Jiang等［2］研究发现，Cramp在衰老的组织和器官中高表达，并与肝硬化等慢性病相关。为深入研究Cramp在衰老中的作用及机制，我们构建了Cramp转基因小鼠。

1 材料和方法

1.1 Cramp表达载体及转基因小鼠的构建

将Cramp cDNA重组到pcDNA3.1+载体中，用Sac I（宝生物工程有限公司）酶切线性化载体，调整浓度为5ng/μL。用显微注射法将上述线性化片段注射入BDF1小鼠受精卵内，用ICR小鼠做假孕受体［小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所康蓝公司，XCXK（京）2004-001］，制备转基因小鼠。实验中设计动物的操作程序已经得到中国医学科学院实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为GC05004。

1.2 PCR方法鉴定Cramp转基因小鼠的基因型

用2周龄小鼠尾尖碱裂解法提取基因组DNA，PCR鉴定基因型。PCR上游引物为5′GGCTGTGGCGGTCACTATC 3′，下游引物为5′TCACCACCCCCTGTTCCTT 3′，引物由上海生物工程技术有限公司合成。PCR反应体系20μL（试剂购自宝生物工程有限公司）。反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。目的片段长度为276bp。

1.3 RT-PCR检测Cramp基因表达

取2～3月龄F1代Cramp转基因阳性及同窝阴性小鼠，Trizol提取小鼠骨髓总RNA，用反转录试剂盒（Ferments）反转录成cDNA，RT-PCR检测Cramp基因表达水平。引物同1.2，产物长度276bp。用glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease（GAPDH）基因做内参，用FAM标记的Taqman探针监测内参，用SYBR GREEN监测目的基因。Taqman探针为ABI公司生产。

1.4 Western blotting检测Cramp蛋白表达

取2～3月龄F1代Cramp转基因阳性及同窝阴性小鼠的肝脏，液氮速冻，切割组织5mg，加入蛋白裂解液600μL，超声破碎组织30s，间隔10s，至组织完全破碎，加入6×蛋白上样缓冲液，沸水煮10min，分装后，冻存于-80℃，备用。肝脏总蛋白进行SDS-PAGE梯度胶电泳（4％～12％聚丙烯酰胺梯度凝胶购自百事创新公司），蛋白转移到NC膜上（Millipore），用5％BSA封闭。一抗（Santa Cruz公司生产）为兔抗鼠Cramp，二抗（购自中杉金桥公司）为HRP标记羊抗兔。HRP标记的鼠抗β-actin（购自中杉金桥公司）为内参。曝光液为Thermo公司生产。

2 结果

2.1 重组质粒Cramp-pcDNA3.1+的鉴定

图1 重组质粒酶切鉴定Fig.1 Electrophoretic identification of recombinant plasmid with restriction enzyme digestion

将重组质粒Cramp-pcDNA3.1+分别用NotⅠ、HindⅢ进行酶切电泳后得到544bp的小片段，与预期大小一致，且连接方向正确，将此重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行序列分析，确认Cramp-pcDNA3.1+序列正确（图1）。

2.2 Cramp转基因小鼠的获得及F0代转基因小鼠基因型鉴定

将Cramp-pcDNA3.1+用SacⅠ酶切后回收纯化的片段显微注射到小鼠受精卵的雄原核中。共注射受精卵344枚，成活275枚，将存活的受精卵移植到10只假母，共产子鼠75只，鼠尾DNA鉴定阳性14只，即为F0代。部分鉴定结果见图2。

图2 部分F0代小鼠鉴定结果Fig.2 PCR analysis of some of F0 generation mice

2.3 RT-PCR检测Cramp基因表达结果

每个founder取2只PCR鉴定阳性小鼠，提RNA后反转录，经实RT-PCR检测，有5个founder为高表达的，分别为L-2、4、9、10、13、14。部分结果见图3。

图3 RT-PCR结果Fig.3 RT-PCR results

2.4 Western blotting检测Cramp蛋白表达结果

每个Founder取2只PCR鉴定阳性小鼠，取肝脏组织提起蛋白样品，Western blotting鉴定3个品系为高表达品系，L-3、13、14，部分结果见图4。

图4 Western blotting结果Fig.4 Identification of Cramp protein by Western blotting

3 讨论

本研究，成功构建了Cramp cDNA载体，用显微注射法建立了Cramp转基因小鼠，获得14只F0代转基因小鼠，将这些小鼠与C57野生型小鼠交配，产生F1代转基因小鼠。通过对F1代小鼠进行RTPCR和Western blotting鉴定，筛选出3个高表达转基因小鼠品系。从RT-PCR和Western blotting结果可以看到，转基因小鼠Cramp的表达量明显高于阴性对照小鼠，我们可以应用此转基因小鼠模型研究Cramp的功能及作用机制。目前对Cramp的研究多集中于其抗菌作用［3-5］，Jiang等［2］研究发现，Cramp蛋白在衰老的组织和器官中高表达，但其在衰老中的作用及机制尚需深入研究。我们构建的Cramp转基因小鼠为这方面研究提供了动物模型。

［1］Gallo RL，Kim KJ，BernfieldM，etal.Identification of CRAMP，a cathelin-related antimicrobial peptide expressed in the embryonic and adult mouse［J］.J Biol Chem，1997，272：13088-13093.

［2］Jiang H，Schiffer E，Song Z，et al.Proteins induced by telomere dysfunction and DNA damage represent biomarkers of human aging and disease［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105：11299-11304.

［3］Kang SW，Lee DG，Yang ST，et al.CRAMP analog having potent antibiotic activity without hemolytic activity［J］.Protein Pept Lett，2002，9：275-282.

［4］Kirikae T，Hirata M，Yamasu H，et al.Protective effects of a human 18-kilodalton cationic antimicrobial protein（CAP18）-derived peptide against murine endotoxemia［J］.Infect Immun，1998，66：1861-1868.

［5］Murakami M，Ohtake T，Dorschner RA，et al.Cathelicidin antimicrobial peptides are expressed in salivary glands and saliva［J］.J Dent Res，2002，81：845-850.