黄瓜抗霜霉病的分子生物学研究进展

王丽娟 孙彩玉 牛 德 秦智伟

（1东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030；2东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨 150030）

黄瓜抗霜霉病的分子生物学研究进展

王丽娟1孙彩玉1牛 德1秦智伟2*

（1东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030；2东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨 150030）

黄瓜霜霉病（Cucumber downy mildew）是由真菌门鞭毛菌亚门古巴假霜霉菌侵染引起的一种世界性病害，已有70多个国家的黄瓜生产受其危害。本文从抗性遗传、分子标记及图谱构建、抗霜霉病基因相关的分离等方面综述了黄瓜抗霜霉病的分子生物学领域的研究进展，并就分子水平研究中存在的问题进行探讨，对今后的研究方向进行了展望。

黄瓜霜霉病；抗性遗传；分子标记；连锁图谱；综述

黄瓜（Cucumis sativus L.）霜霉病是危害黄瓜生产的主要病害之一，已有70多个国家的黄瓜受其危害。有关黄瓜霜霉病的研究很多，主要集中在病原菌、发病规律、生理生化变化以及防治研究等传统生物学方面。近年来，关于黄瓜抗霜霉病的分子生物学研究日益增多，在抗性遗传、抗病基因分离、分子标记及连锁图谱构建等方面取得了不少进展和成果。

1 黄瓜霜霉病抗性遗传规律的研究

Cochran（1983）通过杂交分析证明黄瓜抗病性由数个基因决定；Jenkins（1946）认为抗病黄瓜品种Chinese Long和Puerto Rico37的抗性是由1个或2个主效基因和1个或多个微效多基因控制；Shimizu等（1962，1963）、Thomas等（1988）则认为黄瓜抗病品种Aojihai的抗性是由3对隐性基因控制的，并且这3对基因与控制果皮深绿的基因连锁，Doruchowski和Lakowska（1992）也证明黄瓜对霜霉病的抗性是由3对隐性基因dm-1、dm-2和dm-3决定的；吕淑珍等（1990，1995）研究认为，霜霉病抗性至少由3对基因控制，具有部分显性，其广义遗传力为62.33 %，狭义遗传力为47.74 %，属于遗传力较高的性状，容易稳定；张素勤等（2007a）通过研究认为霜霉病抗性是由2对主基因和多个微效基因共同控制的，黄瓜对霜霉病的抗性，以加性效应为主，主基因遗传力较高，但是微效多基因效应也不容忽视；白智龙等（2008）以抗霜霉病黄瓜品种S94（华北型）和感霜霉病纯系品种 S06（欧洲型）为材料，确定霜霉病抗性属于数量遗传性状，由至少4个位点调控，并推测该多效位点可能与报道的质量性状位点（dm）有关；刘玉石和丁九敏（2008）同样经研究后发现黄瓜抗性遗传以基因的加性效应为主，非加性效应次之；张胜菊和司龙亭（2009）通过全轮配双列杂交试验表明，黄瓜霜霉病抗性至少受2对基因控制，且隐性等位基因较显性等位基因占优势。

但也有报道认为黄瓜抗霜霉病基因是由一单隐性基因（dm）控制。例如，van Vliet等（1974，1977）认为黄瓜抗病品种PI197087的抗性由一个单隐性基因控制，并且认为这个基因与抗白粉病的基因连锁；丁国华（2004）研究认为，黄瓜霜霉病抗感性状分离比符合1∶3，表明黄瓜对霜霉病的抗性由1对隐性基因控制；另外也还有不少报道持相同的观点（Fanourakis & Simon，1987；Pierce ＆ Wehner，1990；Horejsi et al.，2000）。

2 黄瓜抗霜霉病基因的分子标记和连锁图谱的研究

黄瓜是一种基因组较小的作物，约为3×105kb。高密度的黄瓜连锁图谱应有7个连锁组，覆盖基因组范围为750～1000 cM（Staub ＆Meglic，1993）。从早期的利用形态学标记构建图谱到目前的以分子标记为主构建图谱，所构建的黄瓜遗传图谱已达到22张之多。其中有4张抗霜霉病基因常被用作抗病标记位点，包括van Vliet和Meysing（1974）、Kennard等（1994）、Meglic和Staub（1996）、Horejsi等（2000）。丁国华（2004）、张素勤等（2007b）同样对黄瓜抗霜霉病基因进行标记，但标记后的连锁距离始终不够紧密。Horejsi等（2000）通过对960个RAPD引物筛选，在两个抗、感霜霉病群体中找到了5个与dm基因紧密连锁的RAPD标记，其中BC5191100与dm的连锁距离最近，达9.9 cM；Kennard等（1994）也曾获得过一个连锁距离为9.5 cM的RFLP标记；国内丁国华等（2007a）获得了RAPD标记SBSP18-561与dm连锁距离为10.54 cM；随后，又采用RAPD技术转SCAR的方法筛选黄瓜抗霜霉病基因分子标记，在318条RAPD引物中有18条引物表现出两亲本间多态性，其中引物 P18扩增片段与霜霉病抗病基因之间紧密连锁，根据交换率和Kosambi函数公式计算其遗传距离为7.85 cM。同时，研究表明:抗霜霉病基因dm与控制果实绿色的基因D和抗白粉病基因pm有紧密的连锁关系（van Vliet & Meysing，1974；Meglic & Staub，1996；张素勤 等，2007b），并计算出dm和pm的遗传距离为29.1 cM（丁国华，2004）。

3 黄瓜植株抗霜霉病相关基因的研究

由于抗病基因往往存在着一些保守的相似结构域（Ellis et al.，1995；Lawrence et al.，1995），因此根据这些相似序列设计简并引物，从植物基因组中得到的扩增产物与抗病基因有着较高的同源性，并且这些扩增产物往往与抗病基因紧密连锁，或者是抗病基因的一部分（丁国华，2004）。由于获得抗病基因同源序列（RGA）相对容易，因此目前对于抗霜霉病基因的克隆通常以此为入口。丁国华等（2004，2005）利用简并引物从抗霜霉病黄瓜品种基因组 DNA中分离得到多条核苷酸结合位点（NBS）类型RGA，通过核苷酸和氨基酸序列的比对，显示其与已报道的甜瓜RGA有较高的同源性，所克隆的黄瓜RGA基本都含有NBS保守域中P-loop和kinase2保守序列，有些还包含kinase3a特征保守结构甚至NBS保守域的全部4个特征结构；而随后获得的RGA与烟草的N基因、亚麻的L6基因和拟南芥的RPS2基因存在较高同源性，并且发现有些RGA在黄瓜品种间还表现出多态性（丁国华 等，2007b）；曹清河（2006）从抗病黄瓜品种中获得了与抗霜霉病相关的基因序列cpc-1，通过半定量RT-PCR表达分析，发现此基因序列在根、茎和叶中都表达，其表达量的大小顺序为:叶>茎>根；李金鑫（2008）从抗霜霉病黄瓜叶片中分离出4条与黄瓜霜霉病抗性相关的特异表达基因，分别为49-2、50-2、50-7和52-14，研究表明:在抗霜霉病黄瓜受诱导后，这4个基因的表达具有一定的时间和空间差异性，序列比对分析表明，50-7与黄瓜脂氧合酶基因高度同源，其他3个基因为未知新基因。牛德（2009）建立了霜霉菌侵染的黄瓜叶片cDNA文库，通过对所构建的cDNA文库的分析，共发现有427条基因参与植物防御/抗病过程，所得到的2507条非重复序列（unigenes）在NCBI、Swiss-Prot、KEGG和COG数据库比对，确定了468条unigenes为新基因，是以后重点研究对象。

4 问题与展望

在抗性遗传方面，由于不同研究者所使用的试验材料不同，或抗病性鉴定方法和分级标准存在差异，因而得出不同结论。因此，确定统一的实验标准还是必要的。另外，若存在霜霉菌生理小种分化，而不同的实验者如使用不同的霜霉菌生理小种来进行试验，所得到的结果可能也会存在差异。在抗病基因的分子标记方面，其标记还未达到理想距离，标记点连锁距离始终不够紧密。在黄瓜抗霜霉病基因方面争议较大，主要是围绕主效基因和微效基因、显性基因和隐性基因的控制方面。对于抗霜霉病相关基因的功能验证研究相对不多，其中存在诸多困难，包括基因的不确定性、黄瓜遗传转化率不高等问题，因此筛选更为精确的黄瓜抗霜霉病相关基因、优化黄瓜遗传转化体系是黄瓜抗霜霉病研究的重点和难点，在相关基因的功能验证方面还有大量工作需要完成。

黄瓜全基因组测序已完成，为黄瓜抗霜霉病的研究提供了重大帮助。分离黄瓜抗霜霉病相关基因，利用分子育种手段培育高抗黄瓜霜霉病品种，是黄瓜霜霉病分子生物学研究的最终目标。

白智龙，袁晓君，蔡润，刘龙洲，何欢乐，周鸿飞，潘俊松.2008.黄瓜霜霉病抗性QTL分析.自然科学进展，18（6）:706-710.

曹清河.2006.黄瓜抗霜霉病异源易位系选育、相关基础研究及育种应用〔博士论文〕.南京:南京农业大学.

丁国华.2004.黄瓜抗病基因同源序列的克隆及其对霜霉病抗病基因标记的研究〔博士论文〕.哈尔滨`:东北农业大学.

丁国华，秦智伟，刘宏宇，周秀艳，池春玉，王志坤.2005.黄瓜NBS类型抗病基因同源序列的克隆与分析.园艺学报，32（4）:638-642.

丁国华，秦智伟，周秀艳，范金霞.2007a.黄瓜霜霉病抗病基因的RAPD及SCAR标记.西北植物学报，27（9）:1747-1751.

丁国华，池春玉，周秀艳，秦智伟.2007b.黄瓜抗病基因类似序列（RGA）的同源性分析和 Southern鉴定.园艺学报，34（2）:355-360.

李金鑫.2008.黄瓜抗霜霉病相关基因cDNA片段的克隆与分析.园艺学报，35（3）:371-376.

刘玉石，丁九敏.2008.黄瓜霜霉病抗性与生理生化性状相关关系的遗传研究.北方园艺，（3）:201-203.

吕淑珍，霍振荣，陈正武，马德华.1990.黄瓜抗病性遗传研究初报.天津农林科技，（2）:22-22.

吕淑珍，张本群，李淑菊，霍振荣，陈正武.1995.中国主要蔬菜抗病育种进展//黄瓜霜霉病抗病遗传及抗性鉴定方法研究进展.北京:科学出版社:392-394.

牛德.2009.霜霉病菌诱导的黄瓜叶片cDNA文库构建及其表达序列标签（ESTs）分析〔硕士论文〕.哈尔滨:东北农业大学.

张素勤，顾兴芳，张圣平，邹志荣.2007a.黄瓜霜霉病抗性遗传分析.西北植物学报，27（12）:2416-2420.

张素勤，顾兴芳，张圣平，邹志荣.2007b.黄瓜对霜霉病和白粉病抗性的相关性研究.中国蔬菜，（9）:9-11.

张胜菊，司龙亭.2009.黄瓜霜霉病抗性的遗传表现与基因效应分析.北方园艺，（4）:71-72.

Cochran F D.1938.Breeding cucumbers for resistance to downy mildew.Proc Amer Soc Hort Sci，35:541-543.

Doruchowski R W，Lakowska R E.1992.Inheritance of resistance to downy mildew（Pseudoperonospora cubensis Berk. & Curt.）in Cucumis sativus//Proceedings of Fifth Eucarpia Cucurbitaceae Symposium.Skierniewice:132-138.

Ellis J G，Lawrence G J，Finnegan E J，Anderson P A.1995.Contrasting complexity of two rust resistance loci in flax.National Acad Sciences，92（10）:4185-4188.

Fanourakis N E，Simon P W.1987.Analysis of genetic linkage in the cucumber.The Journal of Heredity，78（4）:238-242.

Horejsi T，Staub J E，Thomas C.2000.Linkage of random amplified polymorphic DNA markers to downy mildew resistance in cucumber（Cucumis sativus L.）.Euphytica，115（2）:105-113.

Jenkins J M.1946.Studies on the inheritance of downy mildew resistance and of other characters in cucumbers.J Hered，37:267-271.

Kennard W C，Poetter K，Dijkhuizen A，Meglic V，Staub J E，Havey M J.1994.Linkages among RFLP，RAPD，isozyme，disease-resistance,and morphological markers in narrow and wide crosses of cucumber.Theor Appl Genet，89:42-48.

Lawrence G J，Finnegan E J，Ayliffe M A，Ellis J G.1995.The L6 gene for flax rust resistance is related to the arabidopsis bacterial resistance gene RPS2 and the tobacco viral resistance gene N.The Plant Cell，8（7）:1195-1206.

Meglic V，Staub J E.1996.Inheritance and linkage relationships of isozyme and morphological loci in cucumber（Cucumis sativus L.）.Theor Appl Genet，92（7）:865-872.

Shimizu S，Kanazawa K，Kato A，Yokata Y.1962.Studies on breeding cucumber for resistance to Pseudoperonospora cubensis.Bull Hort Res Sta Hiratsuka ser，1:175-183，185-196.

Shimizu S，Kanazawa K，Kato A，Yokata Y.1963.Studies on breeding cucumber for resistance to Pseudoperonospora cubensis.Bull Hort Res Sta Hiratsuka ser，2:47-64，65-81.

Pierce L K，Wehner T C.1990.Review of genes and linkage groups of cucumber.HortScience，25（6）:605-615.

Thomas C E，Cohen Y，McCreight J D，Jourdain E L，Cohen S.1988.Inheritance of resistance to downy mildew in Cucumis melo.Plant Disease，72:33-35.

van Vliet G J A，Meysing W D.1974.Inheritance of resistance to Pseudoperonospora cubensis rost.in cucumber（Cucumis sativus L.）.Euphytica，23:251-255.

van Vliet G J A，Meysing W D.1977.Relation in the inheritance of resistance to Pseudoperonospora cubensis rost.and Sphaerotheca fuligineapoll in cucumber（Cucumis sativus L.）.Euphytica，26（3）:793-796.

Staub J E，Meglic V.1993.Molecular genetic markers and their legal relevance for cultivars discrimination:a case study in cucumber.Hort Technology，3:291-300.

Progress in Molecular Biology Research on Cucumber Downy Mildew

WANG Li-juan1, SUN Cai-yu1, NIU De1, QIN Zhi-wei2*
（1College of Life Science，Northeast Agricultural University, Harbin150030, Heilongjiang, China; 2College of Horticulture, Northeast Agricultural University, Harbin150030, Heilongjiang, China）

Cucumber downy mildew is a worldwide disease caused by Pseudoperonospora cubensis.It is known around the world that more than70 cucumber（Cucumis sativus L.）producing countries were under its hazards. This paper expounds the research progress made in the field of molecular biology in resistance to cucumber downy mildew from resistance genetics, construction of molecular marker and linkage map, separation related to resistance to downy mildew genes. The paper also discusses about the existing problems in molecular level research, and outlooks the future research orientation.

Cucumber downy mildew; Resistance genetics; Molecular markers; Linkage map;Review

S642.2

A

1000-6346（2010）24-0010-04

2010-07-23；接受日期:2010-10-30

黑龙江省博士后专项科研基金资助项目（LBH-Z07213）

王丽娟，女，副研究员，硕士生导师，专业方向:植物胚胎发育与分子生物学，E-mail:lj_wang@163.com

*通讯作者（Corresponding auther）:秦智伟，教授，博士生导师，专业方向:蔬菜遗传育种，E-mail:qzw303@126.com