姜组织培养研究进展

刘振伟 李庆芝 史秀娟

（山东省莱芜市农业科学研究院，山东莱芜 271100）

姜组织培养研究进展

刘振伟 李庆芝 史秀娟

（山东省莱芜市农业科学研究院，山东莱芜 271100）

对姜的器官（营养芽、花芽、花药）培养、细胞悬浮培养、原生质体培养和植株再生等方面的国内外研究现状进行了综述，并分析了姜组织培养研究中的主要问题。

姜；组织培养；研究现状；综述

姜（Zingiber officinaleRosc.）为姜科姜属植物，是香料家族和药用植物的主要成员，是我国出口创汇的重要蔬菜之一。近年来，随着人们对其营养价值和保健价值的深入认知，姜日益受到人们的关注和青睐。随着组织培养技术的深入发展和广泛应用，许多学者开展了姜组织培养方面的技术研究，在器官培养、细胞培养、原生质体培养，以及植株再生体系建立等方面的研究取得了巨大的成就，笔者对研究成果进行了总结，为进一步深入开展姜组织培养技术研究提供参考。

1 姜各种外植体的初代及继代培养

1.1 营养芽培养

营养芽包括顶芽和腋芽，它们作为外植体时，因培养基成分不同可形成丛生芽或愈伤组织，但常因污染严重而成活率较低。Ravindren和Nirmal Badu（2005）用姜的顶芽和腋芽芽尖，在含不同浓度、不同比例NAA（1.0～4.0 mg·L-1）和BAP（1.0～4.0 mg·L-1）的培养基上进行培养，只有50 %的外植体能成活，其余因污染而死亡；添加不同浓度不同比例生长调节物质的试验表明，NAA和BAP能诱导芽尖产生丛生芽和根；培养基MS+1.0 mg·L-1NAA+4.0 mg·L-1BAP或MS+1.0 mg·L-1NAA是进行姜芽尖快速繁殖的理想配方，丛生芽和根的形成率均在90 %以上；由营养芽培养的姜试管苗比较健壮，苗高8～12 cm，生根3～4条。潘学峰等（1999）报道，姜芽尖的初代及继代培养的基本培养基以N6为宜，KT对芽的增殖效果较佳；在N6基本培养基上，5.0～7.5 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA的激素配比对丛生芽的诱导效果较好，25～30 d可增殖3.3～3.9倍；0.5 mg·L-1的NAA和IBA均能有效刺激试管苗生根，生根率高达100 %。郑永强等（2004a）报道，莱芜大姜芽尖初代培养的适宜培养基为 MS+1.59～2.49 mg·L-1KT+0.23～0.43 mg·L-1NAA+21.08～28.62 mg·L-1蔗糖，成活率超过70 %。

营养芽初代培养所需要的适宜培养基因姜品种不同而有所不同。据报道，兴国九山姜芽尖的适宜培养基为MS+0.2 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1BAP（中国园艺学会，2001）；柳姜1号的适宜培养基为MS+2.0 mg·L-1BAP+0.1 mg·L-1NAA；鲁大姜的适宜培养基为MS+1.0 mg·L-1BAP+0.3 mg·L-1NAA（韦金洋 等，2005）。初代培养出芽率均在90 %以上（中国园艺学会，2001；Ravindren& Nirmal Babu，2005；韦金洋 等，2005）。

1.2 花芽培养

花的分生组织在不同发育阶段经合适的培养基培养，可发育成营养芽、花和种子。用花芽作为外植体进行初代培养与用营养芽作为外植体相比，同等处理条件下污染率相对较低。Nirmal Babu等（1992）将芽龄7 d的姜幼嫩花芽，在MS+10.0 mg·L-1BAP+0.2 mg·L-12,4-D的培养基上培养60～90 d，70 %的外植体形成了营养芽，花芽包叶中的每个腋芽一般发育成1株小苗，偶尔发育成2株，其中约26 %的外植体经诱导形成了5～25个丛生芽，继续培养49～50 d，这些丛生芽都发育成完整小苗；约20 %的外植体因花芽原基已经完成分化，经培养直接发育成花，并能正常开花，完成离体授粉后子房发育成3室果实，种子均能萌发并发育成植株，经培养42 d，能看到从子房中新培养出的单株小苗，这些小苗能够形成根系，随后形成许多分蘖。Vaslala等（1997）在离体条件下亦成功培育出姜的果实。

花芽培养为获得用于冷冻保存的花粉和用于离体授粉的无菌花粉提供了良好途径。离体诱导培养获得种子，打破了姜自交和杂交不育的难题，为姜进行有性繁殖和靠种子育种开辟了新的途径，为姜的品种改良带来了全新的方法（Ravindren & Nirmal Babu，2005）。

1.3 花药培养

花药培养是获得单倍体和二倍体植株的有效方法。Ramachandran和Nair（1992）将姜离体花药在含有2,4-D和椰子汁的MS培养基上培养，获得了愈伤组织、根和类似根状茎的结构。

Samsudeen等（2000）将含有单核花粉母细胞和花粉的花药在0 ℃下分别处理1、2、7 d后，接种在含0.2～0.3 mg·L-12,4-D的改良MS培养基上培养，结果表明经过处理的这些花药在固体培养基和液体培养基上培养约40 d，都能形成易碎的愈伤组织，固体培养基比液体培养基更适合姜花药的培养。研究同时发现，3.0 mg·L-12,4-D既适于愈伤组织的诱导，又适于愈伤组织的增殖。

另有研究证明，用MS+0～10.0 mg·L-1BAP+0～0.2 mg·L-12,4-D的培养基培养姜花粉亦能获得愈伤组织，培养基MS+10.0 mg·L-1BAP+0.2 mg·L-12,4-D最适于器官形成和植株再生，70 %的培养物显示出了形态建成反应，每块愈伤组织能生成1～20个芽，平均12.6个芽，这些芽在 MS+1.0 mg·L-1NAA培养基上扩繁和生根，经炼苗、移栽后，可进行单倍体和二倍体的筛选（Samsudeen et al.，2000）。

1.4 细胞悬浮培养

在特殊的离体培养条件下，特殊发育阶段的特殊部位的植物细胞能积累次生代谢物质，因此，可利用细胞培养来代替整个植株种植进行高价值代谢物质和生物活性物质的生产（Yeoman，1987）。Sakamura和Suga（1989）报道了在姜细胞培养过程中有挥发性物质的生成。Ilahi和Jabeen（1992）也报道了姜愈伤组织培养中生物碱的生物合成的初步研究，培养的细胞转移到新鲜的培养基（MS+1.0 mg·L-12,4-D）上能继续生长和繁殖，每7 d转接1次，可存活2 a以上，在继代培养过程中，部分细胞异化为产油细胞。关于这方面的研究刚起步，产油细胞的数量对工业化开发需求来说是非常少的，因此在姜细胞离体培养用于香料物质的工业化开发之前，还需要开展大量的研究工作。

1.5 原生质体的分离与培养

原生质体的分离、培养和融合是进行植物改良的重要方法。Geetha等（2000）将离体的姜幼小叶片置于0.5 %离析酶R10、3 %半纤维素酶和5 %纤维素酶Onozuka R10的混合酶液中，15 ℃下培养10 h，30 ℃下培养6 h后，机械浸离发生质壁分离的叶片组织，成功分离出原生质体。此方法下原生质体产量达2.5×105个·g-1，原生质体呈球形，55 %具有活力，内部充满了叶绿体颗粒。用细胞悬浮培养的愈伤组织分离原生质体，要求混合酶液的浓度稍有不同，将愈伤组织置于1 %离析酶R10、3 %半纤维素酶和6 %纤维素酶Onozuka R10的混合酶液中，15 ℃下培养10 h，30 ℃下培养8 h，也能够分离出原生质体，每克愈伤组织能产生原生质体1×105个，原生质体呈球形，72 %具有活力，内部没有或含少量叶绿体颗粒。叶片组织产生的原生质体是异质的，含有不同大小的原生质体（0.15～0.21 mm），而由细胞悬浮培养产生的原生质体大都大小统一（0.39 mm）。原生质体培养20 d后，滴于MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1BAP+0.5 mg·L-12,4- D+3 %蔗糖+7 %甘露醇的液体培养基中，2～3 d原生质体开始再生细胞壁，7 d后细胞内含物变浓，每7 d添加1次新鲜培养基，20～30 d细胞开始再生。原生质体置于液体培养基和固体培养基上培养20 d的结果相同。原生质体再生的细胞，在MS+1.0 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1BAP的培养基上培养，2～3 d细胞开始分裂，50～70 d形成微愈伤组织。

2 姜植株再生

2.1 愈伤组织的诱导

愈伤组织的诱导需要适宜的生长调节物质，其中，以2,4-D最为重要。Nirmal Babu等（1997）利用姜的营养芽、幼叶、子房和花药组织，在添加不同浓度NAA和2,4-D的MS培养基上，成功诱导培养出愈伤组织，并探明姜所有外植体在2,4-D浓度为0.5～5.0 mg·L-1的范围内对诱导愈伤组织非常有效，最佳浓度为3.0 mg·L-1；NAA在3～5 mg·L-1浓度下也能诱导出少量的愈伤组织。

郭英华（2005）报道，适于胚性愈伤诱导及扩增的最佳培养基为MS+1.0 mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-1KT+3.0 %蔗糖+0.7 %琼脂。适于姜茎尖愈伤组织诱导培养的培养基有：改良MS+2.0 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-1KT（宣朴 等，2004；戴水莲 等，2008）；MS+1.5 mg·L-1BAP+0.1 mg·L-1NAA（林碧英 等，2002）；MS+0.2 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-1BAP（薛寒青，2007）；MS+1.0 mg·L-1BAP+1.0 mg·L-1IAA（陈娟 等，2007）等。

不同的外植体形成愈伤组织的能力不同，最佳外植体为营养芽，其次是花药，叶片形成愈伤组织的能力最差。姜的愈伤组织疏松、易碎、淡黄色。在继代培养中，愈伤组织会形成一些排列紧密的胚状隆起（拟分生组织），以及大量的疏松细胞（Nirmal Babu et al.，1997）。愈伤组织能进行切割，在相同的培养基上每30 d继代培养1次，可以保存和扩繁增殖（Schenk & Hildebrandt，1972；Pillai & Kumar，1982；Ilahi & Jabeen，1992；Kacker et al.，1993；Nirmal Babu et al.，1997；Ravindren & Nirmal Babu，2005）。

2.2 植株再生

2.2.1 植株再生的培养基配方 由营养芽、幼叶、子房和花药等外植体培养60 d左右的愈伤组织，转接到不同浓度 2,4-D和另加 KT或 BAP的 MS培养基上，可完成形态建成和植株再生（Ravindren & Nirmal Babu，2005）。新鲜的姜愈伤组织，转接到不含生长调节物质的MS基本培养基上只能生根。当KT和BAP单独使用时，即使继代培养4～5代也不会发生器官分化，但添加5.0～10.0 mg·L-1KT和BAP，同时使用0.2 mg·L-12,4-D时，会诱导器官分化和胚状体形成，继而发育成小苗。MS+10.0 mg·L-1BAP+0.2 mg·L-12,4-D的培养基具有最佳的形态建成反应（Ravindren & Nirmal Babu，2005）。改良MS+2.0 mg·L-1BAP+0.5 mg·L-1NAA亦能较好的诱导茎尖愈伤组织的芽分化（戴水莲 等，2008）。营养芽形成的愈伤组织，用BAP比用KT诱导分化的小苗数量多，用BAP能形成28～60株苗，而用KT只诱导分化出8～26株苗。在形态建成后的继代培养中，除去生长调节物质，芽的形成率和小苗形成率都有显著增加（Ravindren & Nirmal Babu，2005）。

培养基MS+10.0 mg·L-1BAP+0.2 mg·L-12,4-D最适于姜叶片愈伤组织的芽诱导培养，含BAP的培养基，每块愈伤组织诱导成芽的数量高达15～35个。芽的形态建成后，转接到不含生长调节物质的MS培养基上，植株再生数量能够增加到30～60株。叶片愈伤组织从分化到形成完整的小苗需要180～240 d，而营养芽愈伤组织只需要150～210 d（Ravindren & Nirmal Babu，2005）。

子房愈伤组织在MS+5.0～10.0 mg·L-1BAP或KT+0.1～0.2 mg·L-12,4-D培养基上，继代培养4～5代后，有67 %～80 %的培养物形成白色、球状、心形的胚状体结构，约有22 %的培养物同时观察到了器官分化和胚状体形成。如果在同种培养基上继代培养，这一过程可以持续发生。把胚性愈伤组织分割，用不含生长调节物质的培养基进行继代培养，愈伤组织逐渐变为绿色，形态建成率显著增高。形成的胚状体随后转接到不含生长调节物质的新鲜MS培养基上，都能发育成完整的植株。研究证明，生长调节剂只有诱导形态建成时才是必需的，愈伤组织一旦转入形态建成阶段，它将保持长期的形态建成能力，这些培养物即使在相同的培养基上重复继代培养两年后，仍保持着较强的形态建成和生成小苗的能力（Nirmal Babu et al.，1997；Ravindren & Nirmal Babu，2005）。胚状体的形成既有紧密排列的也有疏松排列的，体细胞胚状体是进行离体诱变、离体染色体加倍、离体抗逆筛选、DNA直接转移和基因转化等处理的理想靶体（Ravindren &Nirmal Babu，2005）。

理想的生根培养基为改良MS+1.0 mg·L-1NAA，由愈伤组织培养出的芽转接到上述生根培养基上，35 d内能形成很多根系，用液体培养基替代固体培养基根系生长得会更好（Ilahi & Jabeen，1987；Malamug et al.，1991；Kacker et al.，1993；Ravindren & Nirmal Babu，2005）。

2.2.2 外植体对植株再生的影响 研究表明，愈伤组织的诱导及其形态建成能力和形态建成方式因外植体不同而不同。花药愈伤组织转入形态建成的速度最快，其次是子房、营养芽、离体叶片。叶片和花药愈伤组织通过器官发生途径完成植株再生，而营养芽和子房愈伤组织能通过器官发生和胚状体发生两种途径完成植株再生。形态建成所需要的时间和植株再生能力也因外植体不同而不同，子房离体组织最快，需要120 d，叶片离体组织最慢，需要162 d。子房的植株再生效率最高，其次是营养芽、叶片和花药（Ravindren & Nirmal Babu，2005）。

3 姜微繁

许多研究报道，利用姜芽尖和根尖分生组织可以进行微繁，常用的培养基为添加不同浓度、不同比例的IAA、IBA、NAA、2,4-D、KT和BAP的MS培养基，只有Pillai和Kumar使用了SH培养基。

研究表明，不同比例的BAP和NAA组合最适于姜芽的增殖。Nirmal Babu等（1997）利用营养芽、幼嫩花芽、叶片、子房和花药等不同组织作为外植体，用添加BAP或KT和NAA或2,4-D的MS培养基进行了试验。结果表明：MS+0～4.0 mg·L-1NAA+0～4.0 mg·L-1BAP能促进芽和根的诱导，低浓度NAA（1.0 mg·L-1）适于根的诱导和芽的增殖，添加4.0 mg·L-1BAP能促进丛生芽的生成，但抑制根的生成。单独使用高浓度NAA（2.0～4.0 mg·L-1）抑制芽的生长和根的生成，而单独使用高浓度BAP（4.0 mg·L-1）只能诱导形成丛生芽，很少形成根。黄菊辉（1995）报道，姜茎尖在含2.0 mg·L-1BAP和0.6 mg·L-1NAA的MS培养基上可直接形成带根幼苗。叶鞘切段在含1.0 mg·L-1BAP和0.6 mg·L-1NAA的MS4培养基上亦可直接分化不定芽和不定根。雷开荣（2006）报道，在培养基MS+2.0～3.0 mg·L-1BAP+0.5～1.0 mg·L-1NAA上，可以实现姜增殖与生根同步进行，以MS+3.0 mg·L-1BAP+1.0 mg·L-1NAA为最佳继代培养基，继代繁殖周期为25～30 d，繁殖系数在7以上，生根诱导率达100 %。郑永强（2004b）报道，使用KT与NAA搭配时繁殖效率明显高于BAP与NAA搭配，且当2.65 mg·L-1KT与0.43 mg·L-1NAA搭配时繁殖系数最大，为6.4。适于丛生芽快速繁殖的培养基还有：MS+2.0 mg·L-1BAP+0.1 mg·L-1NAA（葛胜娟，2007）；MS+2.0 mg·L-1BAP+0.1 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT（林碧英 等，2002；曾杨 等，2006）；MS+0.2 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-1BAP（中国园艺学会，2001）等。

在同种培养基上同时诱导生根和芽分化，能显著节约姜的繁殖时间，利用姜不同的外植体进行初代培养大约需要60 d才能发育成小苗。利用试管苗丛生芽进行继代培养时，繁殖系数大幅度提高，小苗发育形成的时间每代大约需要45 d。

4 姜试管苗的炼苗与移栽

由于试管苗比较娇嫩，所以姜试管苗需要经过一个逐步的驯化适应过程才能在自然条件下存活，姜科植物靠根茎进行无性繁殖的遗传特性决定了姜试管苗比较容易驯化和适应田间环境（Vincent et al.，1992；Hosoki & Sagawa，1997）。研究证明，直接培养的试管苗炼苗需要22 d，愈伤组织再生植株炼苗需要30 d，炼苗时的植株大小与成活率呈正相关，大苗炼苗后比小苗更容易成活。通常情况下，由营养芽直接增殖形成的小苗比通过愈伤组织再生形成的小苗较大，成活率较高（Ravindren & Nirmal Babu，2005）。另据陈传红等（2006a）报道，在兴国九山姜试管苗扩繁培养基中，添加1.5 mg·L-1多效唑可使试管苗增殖与壮苗同步进行，大大提高移栽成活率。

移栽的适宜基质有表土（潘学峰 等，1999）、等体积腐殖质土与菜园土的混合基质（林碧英等，2002）、等体积菜园土与河沙的混合基质（雷开荣，2006）等，它们都具有很高的移栽成活率。Nirmal Babu等（1997）报道，姜微繁试管苗以及愈伤组织再生植株经炼苗后，移栽于等体积蛭石、沙子和田园土混合的疏松基质中，子房愈伤组织的再生植株移栽成活率最低（57 %），营养芽直接增殖形成的试管苗成活率最高（85 %）。

试管苗移栽后，大多数植株生长形态相似，个别植株叶片易产生黄白色小斑和波状边缘。姜试管苗第1季收获的根茎很小（0.7～3.3 g），收获后若不仔细保存，会很快失水干缩。第2季收获的根茎稍大，第3季能长成与母体同样大小的根茎。因此，姜试管苗不能直接用于商业栽培，在商业应用前至少需要2～3季的保育栽培（Nirmal Babu et al.，1997，1998，2000）。

5 姜微型根茎的离体诱导

许多研究报道了姜根茎的离体诱导培养（Sakamura et al.，1986；Sharma & Singh，1995；Nirmal Babu et al.，1997）。Geetha（2002）试验了不同浓度、不同蔗糖和甘露醇制品对姜微型根茎诱导的影响。在含1 %或1.5 %的蔗糖和甘露醇的培养基上，240 d可形成微型根茎，形成率达50 %～60 %。当蔗糖含量增至9 %、10 %、12 %时，80 %～100 %的培养物形成了微型根茎，并且根茎较大，培养30～180 d，鲜质量达3～15 g，而其他蔗糖与甘露醇的组合未产生微型根茎；Shamrma和Singh（1995）报道，在含75 g·L-1蔗糖的MS培养基上培养的微型根茎具有4～5个芽，质量73～459 mg·个-1；Bhat等（1994）在9 %～12 %蔗糖的培养基上，离体培养获得了姜根茎。郑永强等（2004b）系统研究了蔗糖浓度、外源激素（KT、GA、NAA）、生长抑制剂（B9）、矿质元素及光照时间等对姜试管苗根茎诱导的影响，结果表明 80～110 g·L-1蔗糖是姜试管苗根茎发育的必要条件，外源激素以 GA对姜试管苗根茎的膨大作用最大，显著高于 KT和 NAA。陈传红等（2006b）研究表明，诱导离体微型根茎的最佳培养基为：MS+0.2 mg·L-1BAP+0.5 mg·L-1NAA+2.5 mg·L-1Ca3（PO4）2+2.5 mg·L-1PAC+8.0 %蔗糖；延长光照时间有利于微型根茎的膨大。

微型根茎除了个体较小外，其外部形态与普通根茎相同，有2～4节、1～6个芽，具有姜的浓郁香味和发育良好的油细胞、纤维、淀粉粒和姜黄素细胞。质量分析表明，姜微型根茎与普通根茎含有相同的组分，但是组分含量不同。培养基的成分影响着姜油树脂的组分（Sakamura et al.，1986）。

微型根茎可不经过炼苗直接栽植于田间。室温下，微型根茎在湿润的沙子中贮藏2个月后直接栽植于田间，成活率达80 %。但在栽植后20 d内，一定要注意保持土壤潮湿。2～15 g的微型根茎种植后，产出的根茎鲜质量达100～800 g·株-1，平均产量3.5 kg·m-2，而种植普通姜种的产量为5.0 kg·m-2；20～30 g的微型根茎种植后，产出的根茎鲜质量为400～1 100 g·株-1。同普通姜种繁殖相比，利用微型根茎作姜种的单产较低，但是用种量较少，而且种子无病，因此，微型根茎是栽培用种的理想首选。微型根茎形成的植株，在田间初期生长较慢，但后期生长速度同普通姜种植株一样，微型根茎形成的植株比试管苗植株和普通姜种植株具有较多的的分枝数。田间试验表明，微型根茎比试管苗更稳定（Nirmal Babu et al.，2003）。

6 存在的问题

姜因缺乏种子，只有靠无性选择和诱变技术来开展育种工作，但无性选择和诱变技术又具有局限性和不稳定性。组织培养、体细胞突变、离体突变与筛选等生物技术，为开展姜的育种工作开辟了新途径，但是其中仍有许多难题需要我们解决。首先，对有价值的品种还没有建成系统的安全的离体再生体系，许多技术参数不够细化和系统，缺乏可参考利用的成熟参数。姜组织培养工作各环节的成活系数还较低；姜离体繁殖体系建构周期还较长；离体生物技术育种工作才刚刚起步等；这些问题直接阻碍了利用离体培养技术来代替传统育种技术的发展进程。但是，随着姜产业的全面发展，姜组织培养技术的深入研究，对于姜的良种培育和推广应用将具有十分重要的价值。

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Research Progress on Tissue Culture of Ginger（Zingiber officinaleRosc.）

LIU Zhen-wei, LI Qing-zhi, SHI Xiu-juan
（Laiwu Institute of Agricultural Sciences, Laiwu 271100, Shandong, China）

This paper expounds the internal and external research progress made in ginger（Zingiber officinaleRosc.）tissue culture, including culture of its organ, cell, protoplast and the plant regeneration. The paper also analyzes key issues existing in ginger tissue culture.

Ginger; Tissue culture; Research progress; Review

S632.5

A

1000-6346（2010）10-0009-07

2009-10-23；接受日期：2010-03-05

公益性行业（农业）科研专项经费资助（200903018-3）

刘振伟，男，高级农艺师，专业方向：生姜育种与栽培，E-mail：lwlzw@sina.com