电磁波生物效应对肿瘤化疗增敏效果的研究

张恩科，张瑶婵，马缠过

1．陕西省人民医院 a.设备管理科；b.放疗中心，陕西 西安 710068；2.陕西省西安市中心血站，陕西 西安 710061

电磁波生物效应对肿瘤化疗增敏效果的研究

张恩科1a，张瑶婵2，马缠过1b

1．陕西省人民医院 a.设备管理科；b.放疗中心，陕西 西安 710068；2.陕西省西安市中心血站，陕西 西安 710061

化疗是临床癌症治疗最主要的手段之一。但化疗所存在的药物缺乏特异的敏感选择性和严重的副作用等制约其在临床实践中的推广和应用。本文探讨拟采用生物学与电子工程学的实验技术，在电磁波的生物效应对肿瘤细胞抑制的基础上，研究电磁波的生物效应对化疗的增敏作用，探索提高肿瘤化疗治疗效果的新途径。

生物效应；化疗；增敏；电磁波

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课题背景：此课题为陕西省2008年自然科学研究资助项目（SJ08-2T10），本项目拟采用生物学与电子工程学的实验技术，研究电磁波的生物效应对肿瘤化疗增敏的效果与其作用的机理，探索提高肿瘤化疗治疗效果的新途径。

实验室/团队:陕西省人民医院设备科（医学工程科）和临床医技科室各种医疗仪器和实验测试设备齐全，建有陕西省人民医院设备中心实验室，有包括众多进口测试设备在内的良好实验设备和条件，能在优越的条件支持下开展研发工作，特别是具有能密切联系临床实践的便利。

合作单位西安交通大学生命科学学院建成有生物医学工程研究所和省级重点专业实验室，与我们有长期良好的合作关系，为实现电子信息与临床医学的跨学科研究提供了很好的协作条件，为本项目的支持和协作提供了另一个良好实验研究基地。

实验设计/论文构思：癌症的发生和发展取决于细胞的增殖与凋亡是否平衡，而细胞的凋亡受胞内第二信使Ca2+的调控。胞内Ca2+浓度增加是不同化疗药物诱导癌细胞凋亡的共同通路。细胞中的Ca2+在癌症的发生、细胞的凋亡、化疗对癌细胞的杀伤等几个方面都起着重要作用；而在特定参数的电磁波干预下，正常细胞和癌细胞中Ca2+浓度可以产生不同的变化。能否使用特定参数的电磁波与化疗药物协同作用，其中电磁波参数的选择使癌细胞可产生窗效应，使电磁波与化疗药物分别诱导胞内Ca2+浓度升高叠加，并共同介导癌细胞凋亡，正常细胞则不会出现这样的叠加，从而相对降低化疗药物对正常细胞的毒副作用。Ca2+通道阻滞剂通过对细胞中Ca2+浓度的影响，来逆转癌细胞的多药耐药性，但它会引起许多副作用而不能实用于临床。

应用要点：本项目拟研究电磁波的生物效应对肿瘤化疗增敏的效果与其作用的机理，旨在提高肿瘤化疗治疗效果的新途径，属探索性基础研究。

随着人类生活环境、生活水平和生活方式的变化以及医学的进步，疾病谱发生了显著的变化，一般性传染病逐渐被控制，而恶性肿瘤则日益成为常见且严重的威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一。化疗是临床癌症治疗最主要的成熟的治疗手段之一。但化疗所存在的药物缺乏特异的敏感选择性及同时存在的严重副作用等制约其在临床实践中的推广和应用。如何提高放疗药物的敏感性是国内外科研、制药和医学界专家十分关注的前沿问题[1-8]。

1 研究背景

包括人类在内的多细胞机体均存在细胞不断增殖与死亡。细胞死亡包括坏死 (necrosis)和凋亡 (apoptosis) 两种方式。细胞凋亡是细胞主动的自杀过程，是由基因所控制的细胞自主有序死亡，凋亡体可从上皮细胞表面脱落或被周围细胞吞噬清除，不伴随坏死所特有的炎症反应。凋亡对维持机体的正常发育及内环境的稳定起着十分重要的作用。

在细胞凋亡的诱导中，作为肌醇磷脂代谢途径中细胞信息转导的第二信使，细胞内钙离子（Ca2+）起着十分重要的作用。胞内Ca2+浓度的改变是细胞生理活动的重要物质基础，并在细胞信号转导、诱发一系列细胞功能事件中起重要作用。因此，细胞内Ca2+浓度平衡处于严格的调节控制之中。研究发现，细胞内Ca2+浓度的高低调控着多种类型细胞的凋亡，具体表现为Ca2+内流和聚积可诱导多种细胞凋亡，被认为是细胞凋亡的共同途径。而用钙通道拮抗剂等方法阻止Ca2+内流则可减轻细胞损伤，抑制细胞凋亡。

化疗药物对癌症治疗有效的主要机制之一是诱导癌细胞凋亡。参与调控细胞凋亡的因素很多，包括细胞外信号、细胞内第二信使及细胞内各种酶类。Ca2+作为参与许多生命活动的第二信使，其在调控细胞凋亡中的作用尤其受到关注。大量实验发现，化疗中细胞凋亡主要由细胞内Ca2+介导，化疗药物在诱导对癌细胞的杀伤时均与癌细胞中的Ca2+浓度的增加密切相关。

但目前的化疗方法还存在重要不足。化疗药物缺乏特异的敏感选择性，在杀死癌细胞的同时，也同样会杀伤正常细胞，并由此产生较为严重的副作用，如骨髓抑制、肾毒性导致肾衰、肌体免疫功能抑制、肝功能损伤、胃肠道反应、脱发、口腔溃疡等。另外，毒副反应还会使化疗药物的剂量和疗程受到限制，导致化疗失败。

另外，癌细胞对化学治疗药物产生多药耐药性是癌症治疗不能取得治愈性疗效的重要原因之一。多药耐药性是指癌细胞在接触一种抗癌药物后产生了耐受包括本药物在内的多种结构迥然不同、作用机理也大相径庭的抗癌药物的抗药性。国内外学者在器官、细胞和分子水平上对如何克服癌细胞耐药性的问题，进行了大量研究，发现了一些具有逆转癌细胞多药耐药性的药物，称为化疗增敏剂，其中引人瞩目的是Ca2+通道阻滞剂。Ca2+通道阻滞剂的作用机制是能选择性地阻断Ca2+经细胞膜上的Ca2+通道进入细胞内，从而降低细胞内的Ca2+浓度。但Ca2+通道阻滞剂作为一种具有心血管药理作用的药物，除了可能引起患者的传导阻滞、低血压、充血性心力衰竭等心血管系统的严重毒性反映外，还可能对患者的免疫系统和造血系统产生不利影响。

2 研究思路[9,10]

从前面的介绍中可以看出，癌症的发生和发展取决于细胞的增殖与凋亡是否平衡，而细胞的凋亡受胞内第二信使Ca2+的调控。化疗是目前治疗癌症的主要方法之一，胞内Ca2+浓度增加是不同化疗药物诱导癌细胞凋亡的共同通路。但化疗还存在重要缺陷：化疗药物在诱导癌细胞凋亡的同时，也会对正常细胞产生同样的杀伤；化疗中癌细胞会产生多药抗药性，从而导致化疗失效，适合临床使用的化疗增敏方法目前尚未找到。

细胞中的Ca2+在癌症的发生、细胞的凋亡、化疗对癌细胞的杀伤等几个方面都起着重要作用；而在特定参数的电磁波干预下，正常细胞和癌细胞中Ca2+浓度可以产生不同的变化。所有这些都为下列问题的提出打下了基础：能否使用特定参数的电磁波与化疗药物协同作用，其中电磁波参数的选择使癌细胞可产生窗效应，而正常细胞不会有窗效应时，使电磁波与化疗药物分别诱导胞内Ca2+浓度升高叠加，并共同介导癌细胞凋亡，正常细胞则不会出现这样的叠加，从而相对降低化疗药物对正常细胞的毒副作用。Ca2+通道阻滞剂通过对细胞中Ca2+浓度的影响，来逆转癌细胞的多药耐药性，但它会引起许多副作用而不能实用于临床。注意到电磁波的非热生物窗效应也可影响细胞中Ca2+的浓度，那么电磁波能否用于逆转化疗药物的多药耐药性？需要哪些条件？

3 研究基础

(1)实验结果发现癌细胞内Ca2+出现窗效应对电磁波参数的要求相对正常细胞有其特点，既有相同的一面，又有不同的情况。结合这些特点设法增强化疗药物对癌细胞敏感性杀伤能力的研究已经起步。初步的离体细胞层次的实验表明，一定参数的电磁波可以提高化疗药物对癌细胞的选择性杀伤能力，对正常细胞的杀伤相对可以减轻；

(2)初步建立和改进了不同癌细胞株及其正常对照细胞株、多药耐药性癌细胞株在电磁场干预下化疗药物诱导凋亡的体外细胞研究模型。其中利用改进的多药抗药性离体细胞实验模型相比传统模型具有抗药性程度高，性能更稳定的优势。

以上理论分析和研究表明，无论从科学研究还是临床医学的要求来说，都需要开展对电磁波非热生物效应的进一步研究，探讨电磁波对正常组织细胞和不同种类癌细胞的作用规律和作用机理，并将其应用于改进癌症的治疗，以造福患者和社会。

4 研究方法[11,12]

(1)宽频专用横电磁波传播小室即TEM小室 (Transverse Electromagnetic Cell，横电磁波传输小室) 的研制，可产生不同参数、不同类型的电磁波，这些参数均可实时准确测量；

(2)建立和改进不同癌细胞及其正常对照细胞、多药耐药性癌细胞在电磁场干预下化疗药物诱导凋亡的体外研究模型；

(3)对不同类型癌细胞和正常对照组细胞进行电磁波作用下的非热效应发生条件研究。改变电磁波的类型和参数，反复进行实验，记录各组实验的照片和数据；分析提取可使癌细胞和正常对照组细胞发生非热生物窗效应对电磁波参数的不同要求；

(4)从细胞和分子层次的生物学实验研究、生物系统建模和细胞病理生理等角度对实验结果进行分析解释，探讨癌细胞电磁波非热生物效应的发生机理；

(5)在可使癌细胞发生窗效应，而正常细胞不发生生物窗效应的电磁波协同化疗药物作用下，应用验证细胞凋亡的几种不同方法检查细胞凋亡情况，分别研究化疗药物诱导癌细胞和正常细胞凋亡的情况，分析提出电磁波对化疗增敏方法与效果；

(6)在上述工作的基础上，逐步研究可供动物实验和临床应用的电磁波协同癌症化疗增敏技术。

5 初步成果

本课题研究小组对电磁波干预不同生物组织的非热生物学效应进行研究，完成20多例次实验，取得了一些规律性的有价值的结果。

(1) 不同强度的电磁波对癌细胞增生有明显抑制作用。选择不同强度的电磁波(5mT、8mT、11mT)对人舌鳞癌细胞进行连续3天的辐照刺激，每天1h，通过MTT法和流式细胞术检测细胞的增生、凋亡和细胞周期的变化；对照组采用相同的实验条件和作用时间但不加磁场辐照。结果：MTT法检测实验组与对照组辐照后24h、48h、72h的OD(optical delnsity，光密度)值，通过SPSS软件分析显示实验组比对照组的OD值显著降低(P＜0.01)。流式细胞术检测电磁场组与对照组细胞凋亡率无差异，但细胞周期有显著改变(0.5mT)。

由此得出结论：不同强度的电磁场辐照对人舌鳞癌细胞增生有明显抑制作用，并可阻滞细胞周期，但对舌鳞癌细胞的凋亡未发现明显影响。

(2)电磁波作用于不同癌细胞及其正常对照细胞时胞浆Ca2+浓度窗效应的实验研究。基本步骤是：制备各种细胞样品，包括三种癌细胞及其对照正常细胞；对不同细胞样品进行荧光负载，后用D-Hank’s液洗涤。先将每一样品在激光扫描共聚焦显微镜下进行荧光强度检测，首先获得没有电磁波作用时的基础数据；将这些样品放在电磁波照射系统中接受电磁波辐照，并再次将每一样品在激光扫描共聚焦显微镜下进行荧光强度检测，以获得照射后数据；改变电磁波的类型和参数，反复实验，记录各组实验的结果；然后，对数据进行分析，包括有电磁波作用和无电磁波作用时的数据分析、不同参数电磁波对同一样品作用时的数据分析、不同种类癌细胞对不同参数电磁波作用时的窗效应表现等；最后，通过对各参数电磁波产生或不产生生物学效应的总体分析，寻找出哪些参数电磁波会产生细胞Ca2+的生物学窗效应并对其规律进行归纳总结，特别注意癌细胞相对于正常对照细胞所表现出的不同窗效应特性。

我们采用的荧光探针 (试剂)为Fluo-3，由于 Fluo-3为极性大的酸性化合物，难以进入细胞，而当其结合亲脂的乙酰羟甲基酯(Acetoxymethyl Esters，AM) 成为脂溶性Fluo-3/ AM，再与细胞孵育时，很容易透过细胞膜。电磁波对细胞样品的作用是通过TEM小室来实现的。采用TEM小室是为了获得在较大范围内参数一致的、被屏蔽的均匀平面电磁波，这样，既便于进行准确的生物电磁剂量估计，又可使各样品处于相同的、不受外界干扰的辐照环境中。

实验研究表明，癌细胞表现出的窗效应相对于正常细胞有其类似的一面，但也显示出明显差异。具体表现为：在频率为16Hz、强度为42.5V/m的电磁波作用下，肝癌细胞和正常对照肝细胞均会出现胞内Ca2+浓度明显改变的（频率）窗效应，但肝癌细胞在同样强度、频率为45Hz的电磁波作用下也会出现窗效应，而正常肝细胞在该频率电磁波作用下则不会出现窗效应。

(3)特定参数电磁波协同化疗药物作用对提高癌细胞选择性杀伤效果的实验研究。首先分别培养各种正常细胞和癌细胞样品株，对正常细胞和癌细胞分别加化疗药物后将这些样品放在该癌细胞可产生生物窗效应（对正常细胞不会有窗效应）的电磁波照射系统中接受电磁波辐照。选择不同时间点观察电磁波协同化疗药物作用下对正常细胞的杀伤情况和癌细胞凋亡的情况，研究电磁波协同改善化疗敏感性的条件和方法；对选择性诱导癌细胞凋亡、相对减轻正常细胞损伤的效果做出评价。

窗效应的产生取决于施加的脉冲场强、脉冲时间、细胞大小、细胞种类以及悬浮液或周围组织的条件。通过电脉冲联合低剂量顺铂治疗异种移植人卵巢癌SKOV_3裸鼠，取得了很好的疗效，为特定参数电磁波协同化疗药物作用对提高癌细胞选择性杀伤效果的应用打下了基础。实验表明：高幅度电磁波对肿瘤具有较强的抑制作用，其对肿瘤的治疗作用具有选择性，这种选择性与肿瘤组织的特性以及肿瘤细胞的生物学特性有关。实验中采用的药物剂量远远低于常规化疗剂量，并且在肿瘤部位直接给药，减少了药物总量以及药物的全身循环，毒副作用小。通过对化疗后的裸鼠肾脏做病理检察表明：低剂量药物未造成裸鼠肾功能的损伤。高幅度电脉冲对肿瘤血管的生长具有明显抑制作用。经电场处理的肿瘤表面几乎无血管分布，而未经电场处理的肿瘤表面血管丰富。采用免疫组化法检测肿瘤病理切片中血管内皮生长因子VEGF受体KDR的表达，经电场处理的肿瘤的VEGF受体KDR明显下降，肿瘤血管的生长受到明显的抑制。说明高幅度电场抑制了肿瘤血管的生长，减少或完全切断了肿瘤的营养供应，促使肿瘤细胞凋亡或坏死，达到了治疗肿瘤的目的。

在利用特定参数电磁波协同化疗药物作用对提高癌细胞选择性杀伤效果时应该选择合适的脉冲参数。

6 研究特色

(1)通过大量实验，可以系统研究电磁波作用于不同癌细胞和正常对照细胞株时胞内Ca2+运动的生物学窗效应规律，也为进一步探讨其发生机理提供了更好基础。

(2)在特定参数电磁波协同化疗药物的作用下，研究增强化疗药物对癌细胞选择性凋亡诱导能力的方法。这些研究的开展，可以为克服临床化疗中存在的困难提供新途径。

(3)建立和改进了癌细胞株在电磁场干预下化疗药物诱导凋亡的体外细胞研究模型。我们建立的模型相比传统方法有抗药性程度高、性能更稳定的特点。

(4)动物实验和临床研究中的一些问题，涉及电磁波应用于动物或人体时的使用方法、身体介质衰减和体内分布估计，电磁波协同化疗药物作用时的时间和效果分析。

7 总结

本项目拟研究电磁波的生物效应对肿瘤化疗增敏的效果与其作用的机理，旨在提高肿瘤化疗治疗效果的新途径，属探索性基础研究。但因此项目涉及提高社会资源消耗极大的肿瘤医疗效率提高的问题，所以，即使在项目研究进展上取得很小的突破，也将具有极广阔的经济与社会前景，对肿瘤化疗的治疗效果产生深远的影响。

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Discussion about the Biological Applications of Electromagnetic Waves in Sensitizing Tumors during Chemotherapy

ZHANG En-ke1a,ZHANG Yao-chan2, MA Chan-guo1b

1a.Equipment Management Department; 1b.Radiotherapy Department, Shaanxi Provincial People's Hospital, Xian Shaanxi 710068,China;2. Central Blood Station of Xi'an, Xi'an Shaanxi 710061, China

Chemotherapy is a primary clinical treatment for cancer, but its lack of selective sensitivity and severe side effects limit its widespread use and application. This paper explores the use of experimental techniques in biology and electrical engineering. Based on the observation that electromagnetic waves control tumors, we study how these waves help with sensitization during chemotherapy, and how this may lead to a new way to improve chemotherapy treatments for cancer.

biological effect;chemotherapy;sensitization;electromagnetic wave

Q691.5；R730.53

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2010.06.010

1674-1633(2010)06-0030-04

2009-12-29

2010-03-26

陕西省2008年自然科学研究资助项目(SJ08-2T10)资助。

本文作者：张恩科，副主任技师，陕西省人民医院设备管理科副主任。

作者邮箱：zhangenke@163．com