狐狸源维里纳气单胞菌的分离鉴定

刘 燕,应月青,赵 京,张成林,阎 鹤

(1.北京动物园,北京 西城 100044;2.北京市产品质量监督检验所,北京朝阳 100026)

气单胞菌属为水中常居菌,是水生生态系统中重要的病原菌,致病范围广泛,可引起多种水产动物感染发病[1]。该属主要有嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、维里纳气单胞菌(Aeromonas veronii)等。相比该属中的其他细菌,维里纳气单胞菌报道相对少些。2009年9月中旬,我园多只狐狸相继出现土灰色稀软便,精神沉郁,不爱运动,无食欲的症状。其中两只银狐和一只白狐出现症状一天就死亡,其他经治疗后恢复。取死亡狐狸心血和肝脏,经病原菌检验,分离到一株维里纳气单胞菌,该菌株毒力较强判定为致病菌。具体情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 本园圈养的两只银狐和1只白狐;所用仪器包括立式高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、冰箱、超净工作台、恒温培养箱等;有氧血培养瓶和API细菌鉴定系统试剂条均购于法国梅里埃生物有限公司;脱纤维羊血、营养琼脂培养基等均购于北京陆桥生物技术有限公司;我园自养健康小鼠,体重均约25 g左右。

1.2 分离培养 分别取死亡狐狸心血和肝脏,对血液涂片进行姬姆萨染色,对肝脏组织触片进行革兰染色。同时,将血液接种于有氧血培养瓶,于37℃条件下培养24～48 h;肝脏组织接种于血液琼脂培养基,分别置于有氧和厌氧两种环境下,于37℃条件下培养24～48 h。

1.3 形态学观察 对培养出的细菌菌落进行观察,记录其特征;纯培养物经革兰染色后,观察细菌的个体形态及染色特征;用悬滴法在暗视野下观察细菌的运动性。

1.4 生化特性鉴定[2]挑取纯化的细菌的单个菌落分别做氧化酶、触酶、糖发酵等试验,鉴定其生物学特性。

1.5 半自动鉴定系统鉴定 根据染色结果、氧化酶和触酶试验结果,选择合适的法国梅里埃公司API细菌鉴定系统试剂条进行鉴定。

1.6 致病性 分离纯化的菌株,采用普通琼脂培养基培养24 h,用无菌0.85%生理盐水冲洗菌苔,参照麦氏比浊法测定菌液浓度后稀释至一定浓度,腹腔注射健康25 g体重小鼠测定其致病力。

2 试验结果

2.1 死亡狐狸临床症状及病理剖检变化 3只狐狸在发病症状、剖检病理变化和病理切片等方面都表现出很高的相似性。具体如下:发病症状为土灰色稀软便,有时便中带血,精神沉郁,不爱运动,无食欲,死亡时肛门有出血;剖检病理变化为肠道积气,小肠段浆膜出血明显,胃肠空虚,胃幽门区有出血斑,心肌有出血点,切面内膜出血点,肺出血斑点,左肺大面积突变,肾盂部出血,肝表面颜色不均,局部坏死;病理组织切片病变为心肌细胞大量发生坏死,萎缩,肝脏有细菌团块,脾脏有较多的局灶性淋巴细胞增多,肺淤血较严重,有淋巴细胞浸润,肺泡塌陷。

2.2 分离培养结果 肝脏组织触片见到阴性小杆菌,血涂片经姬姆萨染色见到紫色小杆菌。厌氧培养未分离到细菌。血液和肝脏于有氧条件下均分离到一株较纯细菌。该株细菌革兰染色阴性,杆状(有的稍弯曲),也有接近球状,两端钝圆,无芽孢,单个、成双或短链 ,大小多在 0.3 ～0.7 μ m ×1.2～ 2.5 μ m的细菌。该细菌有运动性。在普通营养琼脂上其菌落特征为圆形光滑、边缘整齐、灰白色、不透明,培养24 h菌落直径多在1.2 mm左右(稍隆起),48 h多在1.8 mm左右(较扁平),生长丰盛;在血琼脂培养基上的菌落圆形光滑、边缘整齐、稍隆起、近乳白色、β-溶血,亦生长丰盛。

2.3 生化试验结果 氧化酶(+),触酶(+),阿拉伯糖产酸(-),乳糖产酸(-),麦芽糖产酸(+),半乳糖产酸(+),棉籽糖(-),吲哚(+),V-P反应(+),七叶苷水解(+),H2S产生(-),水解尿素(-),丙二酸利用(-),硝酸盐还原(+),ONPG(+)。根据该生化试验结果判定为维里纳气单胞菌。

2.4 API鉴定系统鉴定结果 本菌株为氧化酶阳性、触酶阳性的阴性小杆菌,选择API20E鉴定试纸条进行鉴定。鉴定结果为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila),鉴定率为80%。

2.5 致病性试验结果 将该菌株24 h培养物稀释至一个麦氏单位,腹腔注射体重为20～30 g的小鼠,对照注射普通肉汤。设置0.25 mL、0.5 mL、1 mL 3种注射量(因小鼠数量有限,每种注射量各注射1只小鼠)。结果除对照外其他小鼠均于6 h内死亡。并从死亡小鼠的心血中分离到较纯的维里纳气单胞菌。说明该菌是小鼠死亡的致病菌株。

3 结果与讨论

API鉴定系统鉴定结果和生化试验鉴定结果不完全符合,而且鉴定百分率也只有80%。分析原因是因为本试验使用的API鉴定系统的数据库中不包含维里纳气单胞菌。根据生化试验结果,认定该菌株应为维里纳气单胞菌(Aeromonas veronii)。动物试验结果表明,该菌株毒力很强,可以肯定为这次狐狸发病甚至导致死亡的病原菌。该菌株已申请保存于中国兽医药品监察所附属的中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

维里纳气单胞菌是于1983年为纪念法国微生物学家Véron而命名的新种。该菌主要引起水产动物致病,如斑点叉尾鮰、锦鲤、泥鳅、中华绒螯蟹[3]等等,是水中的常居致病菌。对非水产动物以及人类致病主要通过饮水、食用鱼类或伤口接触水被感染等发生。可以引起动物或人食物中毒[4]、水源性肠道疾病以及死亡等等。预防该菌属的流行主要通过加强饮水、食品卫生来控制。

[1]周庭银.临床微生物学诊断与图解[M].上海:上海科学技术出版社,2007:193-195.

[2]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:117-119.

[3]房海,陈翠珍,张晓君,等.中华绒螯蟹病原维氏气单胞菌的检验[J].中国人兽共患病学报,2008,24(1):45-49.

[4]杨守明,几起嗜水气单胞菌引起的食物中毒流行病学特征分析[J].中华疾病控制杂志,2009,13(2):206-207.