猪瘟病毒及疫苗应用研究概况

衣翠玲

1.猪瘟流行特点

从20世纪70年代末开始，各养猪国家猪瘟流行的特点以温和型猪瘟为主，为周期性，波浪型的地区散发流行。其特点是无名高热，症状不典型，持续性感染。在我国猪瘟流行呈典型和非典型猪瘟共存；持续感染与隐性感染共存。本病呈世界性流行，为高度接触性传染病。

程喜莱报道，2001年1～3月湖北某种猪场免疫猪群暴发了一种以高热，高死亡率为特征的传染病，经检查确诊为猪瘟。郭麦芳报道，2008年初陕西某区养猪场免疫注射过的200余头后备猪发病，经实验室检查确诊为猪瘟和附红细胞体混合感染。一些发达国家采取严格卫生防疫措施和净化猪群来控制和消灭了猪瘟。如美国，加拿大，澳大利亚，日本，巴西等。造成猪瘟流行原因还有：①疫苗的质量存在问题，免疫后，抗体水平不能防止亚临床感染水平，可使强毒在猪体内复制和散毒；②联苗效果不确实，据有关资料报道应用三联苗免疫的猪群不断出现免疫失败的病例，使养猪业造成较大的损失。

2.病原

猪瘟病毒（CSFV）是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(pcstivirus)中的一个成员，属于有囊膜的RNA病毒，基因组为单股正链，相对分子质量约为12300，含有一个大的开放性阅读框(openreading frame，ORF)，其两侧分别为5’-非翻译区(5’-UTR)和3’-非翻译区(3’-URT)CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由ORF所编码，翻译成1～3898个氨基酸的多聚前体蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为5’-Nprv、C、E0、E1、E2、P7、Ns2、Ns3、Ns4A、Ns4B、Ns5-3’。其中C为核衣壳蛋白，E0、E1、E2为结构糖蛋白，其余均为非结构蛋白。在结构蛋白中最具有免疫防制研究价值的是E0和E2。E0由227个氨基酸残基构成，相对分子质量为44000～48000，可诱导产生中和谱很窄的中和抗体。E0不仅是一种结构蛋白，而且也是一种功能蛋白，它与CSFV对宿主细胞的嗜性以及致病力有密切关系，可降解病毒和细胞的RNA，可导致免疫抑制，引起动物和淋巴细胞凋亡。E2的相对分子质量约为了53000～55000，E2参与病毒对细胞的感染过程，携带有能刺激机体产生保护性免疫的抗原决定簇，其编码的gp55蛋白是猪瘟的主要保护性抗原。E2囊膜蛋白共包含371个氨基酸残基，是主要的抗原表位集中区。A／D区中69011～766aa区域是一段高抗原性的表位集中区。刘珂等以E2基因阳性质粒为模板。PCR扩增出E2囊膜糖蛋白上A／D抗原区B细胞表位8788aa～938aa，构建出表达质粒PEFAD，转化到BL21大肠埃希菌原核表达系统中进行诱导表达。猪瘟病毒的分离一般采取病死猪的脾或淋巴结等含毒量高的组织，研磨过滤，将滤液接种于原代细胞或细胞系进行病毒分离。CSFV能在猪肾细胞和其他一些哺乳动物细胞内增殖。

3.猪瘟诊断方法

3.1 病毒分离

猪瘟病毒的分离一般采取病死猪的脾或淋巴结等含毒量高的组织，研磨过滤，将滤液接种于原代细胞或细胞系进行病毒分离。CSFV能在猪肾细胞和其他一些哺乳动物细胞内增殖。

此法具有准确诊断的优点，但不利于对病毒核酸序列的分析。

3.2 荧光抗体试验

Robertson等首次将荧光抗体(Fluorescentantibody，FA)运用于猪瘟病料和组织培养物的检测，利用高效价的特异性免疫血清，提取IgG，进行荧光标记。FA法简单、快捷、可靠。许多国家将它作为猪瘟消灭计划的法定诊断试验。

3.3 血清中和试验

该实验可检出动物体内的抗体。按不同稀释度血清抑制病毒产生细胞病变的瓶数，计算被检血清的中和效价。

3.4 间接血凝实验

用该方法检测猪瘟抗体消长动态。此方法操作简单，无需特殊仪器设备，特异性强而不与其他传染病阳性血清发生交叉凝聚，快速(2h内可判定结果)和重复性好等特点。

3.5 免疫酶测定技术

saunder等报道应用快速酶标记抗体微量技术检测猪瘟抗体的方法。通过对640份血清进行检测表明，酶标记抗体法和血清中和试验的符合率在99%以上，而且仅需2h就可获得试验结果。

3.6 斑点ELISA

此方法简便、快捷。谷均相等利用此法对丹东种猪场2718头猪进行了检测，并根据抗体效价情况对其猪进行了免疫接种。

3.7 RT-PCR

是以病毒RNA为模版进行反转录后，再以PCR进行核酸扩增来检测CSFV的方法。具有特异性强、灵敏度高、重复性好、检测时间短等特点，适合临床应用。

3.8 鉴别PCR

此方法简化了检测步骤，缩短了检测时间，提高了病毒的检出率，可用于疾病的诊断和流行病学调查。

4.猪瘟疫苗的应用

20世纪40年代人们开始了对猪瘟病毒进行兔体适应的试验研究。1903年DeSchweinitz和Dorset首次证明CSFV是一种滤过性病毒。人们采用各种免疫方法预防和控制猪瘟。其中应用最广泛的有中国的兔化弱毒疫苗株，又称中国株或C株。日本的细胞弱毒疫苗株GPE及法国的Thivervat株。它们在猪瘟的控制中都发挥了重要作用。大多数弱毒活疫苗是在C株的基础上开发形成的。孙伟等对不同日龄的猪用不同剂量猪瘟兔化弱毒疫苗进行免疫，通过正向间接血凝试验进行猪抗体监测。结果表明：仔猪在吃乳前和60日龄进行免疫效果较好，其抗体使仔猪在整个饲养期内可以得到保护。所以猪瘟疫苗的三大品系疫苗(中国的C株，日本的CPE株和法国的Thiverval株)的广泛应用，对于控制猪瘟的流行起到了关键作用。

随着分子病毒学技术的不断提高，猪瘟疫苗的研究也取得了新的进展。如对猪瘟病理基因组织结构和功能，尤其是主要抗原基因结构和功能的研究不断深入，为猪瘟疫苗，尤其是各种标记疫苗的研究提供了理论依据。因此，各种CSFV基因高效表达系统的建立和完善，为标记疫苗的开发应用奠定了基础。

4.1 猪瘟亚单位标记疫苗的研究应用

所谓亚单位疫苗(subunitvaccine)是指它含有病原体的一种或几种抗原，而不含有病原体的其它遗传信息。亚单位疫苗是不含有感染性组分的，因而无需灭活，而且也无致病性。猪瘟亚单位疫苗主要是殿囊膜糖蛋白的单位标记疫苗，但这种疫苗免疫原性差。产生保护性抗体的时间较长，不适用于紧急接种。Dwulf等研究了E2亚单位标记疫苗。在对试验条件下，疫苗对猪群进行了2次免疫能提供临床保护，但不能阻止CSFV间接触感染，而且免疫以后需2周才能达到完全保护，证明不适用于紧急接种。一种成功的疫苗必须对受体有良好的免疫保护作用。首先要明确编码具有免疫活性的特定抗原的基因。

4.1.1 表达系统

应用重组DNA技术研制亚单位疫苗。表达系统主要有原核生物，酵母细胞和杆状病毒-昆虫细胞系统等。

4.1.2 猪瘟E2亚单位疫苗

CSFV分子抗原性研究的主要成果之一就是确定了E0、E2在诱导抗猪瘟保护性免疫中的重要地位。Wensvoort等用13株CSFV单抗系统研究了CSFVBrescin株表面的抗原决定簇，提出了CSFV表面抗原结构域空间分布和功能关系的一个抽象模型，其研究表明，CSFV表面的单抗决定簇主要分布在四个抗原结构域即ABCD内。13株单抗检测93株CSFV的结果表明，不同的CSFV分离株分型的结果不能预测分离毒株的毒力，他认为CSFV的这4个抗原域位于CSFV的同一结构蛋白上。WeUand等用体外试验结果说明这个结构蛋白就是CSFV的e2糖蛋白。Hammond等还报道了有关CSFVE2重组猪腺病毒(rpAVgP55)活载体疫苗的DNA质粒(核酸疫苗)联合免疫的研究，可100%保护断奶仔猪，75%保护断奶前仔猪。Yu等、Hummand等和Andrew等分别构建了CSFVE2基因的重组表达质粒，并且证明它对猪有较好保护作用。2000年desmit等利用中国C-株的基因组DNA拷贝构建了2个重组CSFV(F1C2、T1C3)，试验表明，重组病毒在兔和猪中保留了父代C-株的生物学特性和免疫原性。C株全长CDNA可作为基质以开发活的重组CSFV株标记疫苗。它是建立快速，准确的CSFV诊断试剂盒的基础。

4.1.3 猪瘟核酸疫苗

用猪瘟病毒E2蛋白基因的表达载体直接作为免疫动物的DNA疫苗是近年来猪瘟病毒免疫研究的热点领域，DNA疫苗可以诱导体液免疫，又可诱导细胞免疫。

4.2 免疫预防

在免疫监测的基础上，确定免疫时间，免疫次数，剂量，制定出一个既能抵抗猪瘟临床感染又能防止亚临床感染和阻止强毒在体内复制和散毒的一种有效措施，是控制本病传染的关键。

总之，随着兽医学、免疫学和分子生物学技术的发展，猪瘟的防制措施和诊断方法更精确，为猪瘟最终控制和消灭奠定—定的基础。