卵黄抗体在饲料添加剂中的应用

西北农林科技大学动物医学院 韩水仲 田泽华 赵津子 张小莺＊

陕 西 理 工 学 院 陈琛

卵黄抗体（IgY）是从经过免疫注射特定抗原的产蛋鸡卵黄中提取的特异性抗体。相对于哺乳动物，由于种系发生学距离的优势，禽更适合生产针对哺乳动物细菌和病毒性疾病的抗体，而对肠道正常的菌群无副作用，避免产生药物残留和耐药性。卵黄抗体具有产量高，制备简单，生产成本低，便于大规模产业化生产，并且理化性质稳定，具有一定的抗酶解能力（张小莺等，2004）。饲喂含卵黄抗体的饲料在节约成本的同时，能够有效预防疾病，增强机体的免疫机能，且卵黄本身也是很好的蛋白来源，卵黄中除了含有特异性卵黄抗体外还含有蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸等多种氨基酸，同时还含有卵黄高磷蛋白、唾液酸、低聚糖等抗细菌和病毒、免疫调节等功能生物活性物质，这增加了其作为饲料添加剂的优势。

1 IgY的理化性质

IgY是一种7 S免疫球蛋白，与哺乳动物IgG略有不同，等电点为5.7～7.6，分子质量约为180 ku，由两条轻链和两条重链组成，分子质量分别为22～30 ku和60～70 ku。IgY的pH值稳定性较好，活性保持良好，在pH 4.0～11.0时比较稳定，pH 3.0～3.5时活性迅速下降，pH 12.0时活性亦有所下降，在pH>12.0时迅速失活。IgY也具有良好的耐热能力。在低于75℃条件下，IgY具有良好的热稳定性；65℃，可保持24 h以上，70℃时加热90 min后其活性才明显下降，高于80℃，大部分IgY将失去活性。IgY制剂在4℃贮存5年或在室温贮存6个月其活性仍无明显变化或下降；IgY对胃蛋白酶有较好的抵抗力，但对胰蛋白酶十分敏感（张小莺等，2004）。在通常情况下，IgY基本能耐受巴氏消毒；IgY具有耐高渗性能 （在60%的高浓度蔗糖溶液中仍有活性）和很好的耐反复冻融的特性。IgY还有一些不同于哺乳动物IgY的特殊生物学特性，它不与金黄色葡萄球菌C蛋白结合，不与哺乳动物DE受体结合，不与类风湿因子发生非特异性反应，对哺乳动物补体无固定作用，因而在检测诊断中特异性强，灵敏度高。

2 IgY的提取

IgY的纯化方法很多，生产上根据抗体纯度的要求，结合生产成本，考虑到对环境的影响，选择不同的方法。生产IgY添加剂，可以对卵黄进行粗提取。粗提主要有水稀释法、有机物沉淀法、有机溶剂抽提法和生物制剂提取法等，其中水稀释法最为简单和经济，利用卵黄抗体可溶于水的特性，除去不溶的脂蛋白。Akita等（1994）使用此法，每毫升卵黄中获得9.8 mg的抗体，回收率达到了91%。有机物沉淀法使用的有机溶剂主要有PEG6000、硫酸葡聚糖等，有机溶剂如氯仿，生物制剂如角叉藻胶等也都能够较好地去除脂蛋白，获得卵黄抗体。IgY的进一步纯化，可以使用层析技术，常用的有凝胶层析和离子交换层析法，两种方法对IgY活性影响较小（江千舟，2000）。此外，也有用亲硫层析、超滤等方法对IgY进行纯化。特异性IgY的获得可以使用亲和层析进行，获得的IgY特异性好、纯度高，但其成本较高。

3 IgY的稳定性保护

卵黄抗体为免疫球蛋白，作为添加剂，如何有效保护其在胃肠道内不被消化酶水解，同时在胃肠道酸碱环境下保持其稳定性，是发挥其作用的首要问题。对于幼龄动物，消化系统尚未发育完全，IgY可抵抗其消化酶的消化，故可将一定量的针对某些疾病的IgY添加到饲料或饮用水中，使幼龄动物获得被动免疫保护。对于成年动物，为了减少添加的IgY的损失，可采用一定的措施，如IgY的优化和设计。

Shimizu等（1992）用蛋黄中提取的卵磷脂和胆固醇为壁材，用脱水-复水法对IgY进行包埋，制成脂质体，试验发现脂质体包埋的IgY在酸性条件下稳定性显著提高，在pH 2.8条件下处理1 h后，稳定性变化不大。Shimizu等（1994）发现，在IgY溶液中加入30%～50%的蔗糖或转化糖可显著提高IgY在75～80℃的抗热变性和在pH 3.0时的抗酸变性能力。此外，柠檬酸盐、磷酸盐、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、乳糖等对IgY的热稳定性均有一定保护作用。Li等（2009）研究了以壳聚糖-海藻酸钠微囊为载体对卵黄抗体的口服保护效果。在pH 5.0获得了最佳的空白微囊，装载IgY后负载率达到了16.72% ～19.69%，pH 3～6对负载率无影响，抗体包封率在pH 3.5时可达最大，即73.93%，但是随pH下降而降低。通过包被保护，IgY在模拟胃液中的稳定性明显加强，处理2 h后，仍然保留61.36%～74.61%的活性，同时载体对IgY的释放率的影响可以忽略。将包被的IgY置于模拟肠液中，微囊开始降解，使IgY获得持续释放，同时有一个疗效的突增点。壳聚糖、海藻酸钠是聚合电解质，两者带有相反的电荷，静电吸引下可以形成混合聚合电解质膜，反应条件温和，可以保留生物大分子的很大部分活性。

4 IgY添加剂在动物养殖及饲料方面的应用

4.1 IgY添加剂在仔猪生产中的应用

4.1.1 IgY添加剂防治仔猪细菌型腹泻 细菌是导致仔猪腹泻的直接原因，大肠埃希菌（E.coli）是主要的致病菌。IgY可附着在细菌的细胞膜上，改变细胞膜完整性或附着在细菌的菌毛上，阻止与肠绒毛细胞上的菌毛受体结合，使E.coli无法黏附在小肠黏膜上，或变为非病原菌而排出体外。Yokoyama等（1992）通过体外黏着抑制试验证实了上述作用。高云英等 （2003）将K88+、K99和987P灭活后，等量混合免疫产蛋鸡，仔猪口服卵黄抗体，预防保护试验达到90%以上，攻毒保护试验达到98%，试验显示卵黄抗体在治疗上优于痢特灵和庆大霉素。

在选择试验菌株时，大部分人选用标准菌株，也有一些研究者选用地方株，如Marquardt等（1999）用地方株 ETEC（K88+）诱导腹泻的 3 日龄仔猪，在用卵黄抗体后24 h被治愈，而用未免疫母鸡蛋黄粉处理组仔猪继续腹泻，其中62.5%因严重腹泻而死亡。在21日龄断奶仔猪的感染试验中，饲喂卵黄抗体粉后有短暂的腹泻，试验期间100%存活，且体重明显增加，而对照组则出现严重的腹泻和脱水症状，且48 h内有仔猪死亡。对猪场14～18日龄的断奶仔猪的饲喂试验表明，饲喂含卵黄抗体日粮的仔猪腹泻发生率和严重程度上均比饲喂含抗菌素的商品日粮组低。

Owusu-Asiedu等（2003）研究发现，人工感染E.coli后，不添加IgY的PPI组严重腹泻，并持续7 d，有33%的死亡率，而添加IgY组只发生轻微腹泻。在检查粪便时，75%在感染6 h后都呈阳性，但24 h后，PPI组中添加IgY组只有50%检查出K88+，而对照100%检出，显示出IgY在抵抗ETEC（K88+）能够提供被动保护，特别是在以植物蛋白为饲料的情况下，能够改善采食量，使断奶仔猪增重。王吉谭等（2004）使用含有抗K88+、K99和987P的卵黄抗体粉饲喂断奶仔猪后发现，饲喂2周高免全蛋粉能显著提高日采食量、平均日增重和饲料转化率，效果与血浆蛋白组相似，并且有提高采食量的趋势，试验发现饲喂高免全蛋粉能有效防治断奶仔猪腹泻，日粮中添加卵黄抗体能显著降低肠道中大肠杆菌数，增加绒毛高度，降低隐窝深度，在获得与血浆蛋白相同的生产性能条件下，较大地降低了生产成本。

4.1.2 IgY添加剂防治仔猪病毒性腹泻 猪流行性腹泻病毒 （PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）是引起猪发生腹泻主要病毒性病原体，发病率、死亡率较高，给养猪业带来严重经济损失。对于曾发生过PEDV的猪场或接种过PEDV弱毒疫苗的妊娠母猪，仔猪主要通过吸食初乳来获得对PEDV的抵抗力，而一旦暴发猪流行性腹泻，目前尚没有特别有效的防治措施。卵黄抗体与初乳作用机理相似，仔猪口服IgY或将IgY添加到饲料中可以提高仔猪的免疫力。Kweon等（2000）使用PEDV免疫鸡，然后提取和浓缩卵黄抗体（I-gY），在仔猪人工感染PEDV后，口服IgY的仔猪，存活率达到85%，而对照组存活率仅为53%。同时，为了测定IgY的预防效果，在PEDV阳性的三个农场对出现腹泻症状的仔猪口服IgY进行治疗，虽然三个农场的存活率有些变化，但是总体上，使用IgY治疗的仔猪存活率为49.24%，而对照组为33.71%，效果明显。宋维平和徐福（2003）使用抗PEDV的卵黄液饲喂感染仔猪，治疗组的死亡率仅为16.7%，相对于全部死亡的对照组，差异极显著。TGEV可导致2周龄仔猪大规模死亡，Zuo等（2009）发现，缺乏母源抗体的仔猪，口服抗TGEV的卵黄抗体，人工感染TGEV后，死亡率仅为12.5%，而对照组高达50%，在发生TGEV的两个猪场，口服卵黄抗体的仔猪存活率为82.35%，对照组为36.84%，差异显著。

4.1.3 IgY添加剂对猪生产性能的影响 饲喂特异性卵黄抗体能够提高增重和猪肉产品的质量。姜锦鹏等（2007）使用脂肪组织细胞膜蛋白制得的卵黄抗体，在猪的生长前期饲喂添加卵黄抗体（75 mg/kg），平均日增重提高了13.03%，饲料报酬率提高7.49%，瘦肉率提高10.3%，背膘厚下降24.14%，肾周、肠系膜、皮下脂肪指数都下降，并可改善肉色。胆囊收缩素（CCK）是一种重要的内源性生理饱感因子，参与摄食和体重调节。脂肪细胞膜蛋白卵黄抗体可抑制前脂肪细胞的增殖，并诱导细胞凋亡而影响脂肪合成，但是其对脂肪细胞无明显的细胞毒作用。余冰和林晓钦（2009）研究了含胆囊收缩素（CCK）抗体的卵黄粉对断奶仔猪生产性能及养分消化率的影响，结果发现，与对照组相比，试验组仔猪血清中CCK浓度下降，试验组平均日采食量（ADFI）提高了6.92%、平均日增重（ADG）增加了 12.14%，料肉比（F/G）降低了4.62%，同时，随着含CCK抗体卵黄粉添加水平的增加，粗蛋白质消化率随添加量增加呈二次曲线变化。

4.2 IgY添加剂在养禽上的应用

4.2.1 IgY添加剂在防治禽细菌性疾病的应用Lee等（2002）研制的抗肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门菌制备的卵黄抗体，在体外抑菌试验中，0.9 mg/mL的抗肠炎沙门氏菌卵黄抗体能够显著抑制肠炎沙门氏菌的生长，0.63 mg/mL的抗鼠伤寒沙门氏菌也出现同样情况，但是抑制效果不如抗肠炎沙门氏菌卵黄抗体，免疫荧光和免疫电镜能够观察到卵黄抗体特异地结合到细菌表面抗原。Rahimi等（2007a）分别使用含抗沙门氏菌的卵黄抗体粉和不含抗沙门氏菌的卵黄抗体粉，卵清和少量奶粉等作为饲料饲喂雏鸡。在人工感染试验中，饲喂添加有卵黄抗体粉的雏鸡在试验期间，粪便中分离到沙门氏菌的数量相对于未添加组显著降低，28日龄时，粪便中未分离到沙门菌，在对肠内容物分析时发现，使用卵黄抗体组相对于对照组，沙门菌浓度显著降低，说明卵黄抗体可以抑制沙门菌在肠黏膜上黏附，并且在肝脏、脾脏、回肠的组织学检查中，卵黄抗体组沙门氏菌量显著低于对照组。

Mahdavi等（2010）研究发现，感染 E.coli O78∶K80的雏鸡，回肠中含有较多的E.coli O78∶K80，同时其白细胞总数、淋巴细胞比例、血液和肠道中分泌型IgA的浓度，空肠中球状细胞、淋巴滤泡的数量等都提高。在将抗E.coli O78∶K80卵黄抗体添加到饲料中饲喂雏鸡后，发现饲喂含0.2%和0.4%特异性IgY和0.4%非特异性IgY对感染雏鸡回肠中E.coli O78∶K80的增殖抑制作用明显。试验发现，饲喂特异和非特异性的卵黄抗体能够增加肠绒毛的高度和隐窝深度，并能降低空肠中球状细胞和淋巴滤泡的数目。结果显示，口服3周含0.2%特异性的卵黄抗体能够改变肠道健康指数和雏鸡对O78∶K80的免疫应答。此外也有报道用卵黄抗体预防和治疗火鸡和蛋鸡中的弯曲菌病，如Tsuokura等（1997）使用卵黄抗体在鸡中进行预防和治疗实验，在预防试验中发现，卵黄抗体能显著减少粪便中弯曲菌的数量（达到99%），但是治疗组效果低于预防组（80～85%）。

4.2.2 IgY添加剂在防治禽病毒性疾病的应用卵黄抗体除了能很好地治疗传染性法氏囊外，在其他病毒性疾病方面也有广泛应用。Rahimi等（2007b）使用灭活的H9N2禽流感病毒制得的卵黄抗体，饮用含有此卵黄抗体（15 mL/3.84 L）的雏鸡，在鼻内人工感染病毒进行攻毒试验时，其粪便中病毒的含量仅为12.5%，而对照组为87.5%，差异极显著。于可响等（2008）使用四株鸭肝炎病毒（DHV）地方株制得的卵黄抗体保护雏鸭效果明显，试验组死亡率比攻毒组显著降低，治疗效果也比较明显，雏鸭存活率达到70%以上。李建鑫和吴忆春（2006）研究发现，在感染DHV后24 h，对雏鸭肌注卵黄抗体保护作用最好。

4.2.3 IgY添加剂对禽生产性能的影响 饲喂含有卵黄抗体的饲料不仅能够预防疾病，同时也能提高动物增重率。朱锦兰和李焕友 （2004）将抗K88、K99、p987 卵 黄 抗 体 添 加 到 肉 鸭 饲 料（0.1%），结果表明，试验组日增重显著高于对照组，在幼鸭阶段，试验组料重比比对照组低，且差异显著，但是在大鸭阶段，试验组虽然比对照组低，但无统计学意义。同时，在对胰蛋白酶的活性测定中发现试验组各小肠段的胰蛋白酶活性分别比对照组高10.79%，可以提高肉鸭对蛋白质的消化利用。试验还发现卵黄抗体可以提高外周血液中甲状腺激素的含量，特别是T3。Decuypere等（2005）研究表明，血液T3水平与禽类生长正相关，提示卵黄抗体影响甲状腺激素水平参与禽类生长的调控作用，从而提高肉鸭生长率，并且试验发现肉鸭血液中胰岛素样生长因子（IGF-1）也出现提高。IGF-1是哺乳动物和禽类真正的生长调节因子，生长激素（GH）的促生长作用通过IGF-1介导。同时，研究者还研究了卵黄抗体和金霉素联用对肉鸭生长性能的影响，结果表明，卵黄抗体和金霉素合用在显著降低采食量的情况下，提高日增重、胸肌率、腿肌率，降低了腹脂率。

4.3 IgY添加剂在水产上的应用 李肖梁等（2006）使用灭活的嗜水气单胞菌免疫产蛋鸡，将获得的卵黄加入一定的赋型剂干燥后添加到中华鳖饲料中，研究表明，添加2‰抗嗜水气单胞菌卵黄组平均日增重比对照组和2‰无特异性IgY添加剂组提高0.148 g，差异显著，而平均死亡率降低了66.7%、45.5%，同时添加2‰抗嗜水气单胞菌卵黄组平均摄食时间比对照组缩短了24.15%。攻毒试验显示添加2‰抗嗜水气单胞菌卵黄组死亡率比对照组和2‰无特异性IgY组分别降低了80.8%和79.2%，肾脏中细菌数也明显减少。

Kim等 （2004）将对虾白斑综合症病毒（WSSV）的外壳蛋白基因 VP28、VP19融合成TrVP 28∶19在E.coli表达，将表达产物作为抗原免疫获得IgY后，用来对中国对虾进行人工感染保护试验，阳性保护率达到80%以上，然而在保护率和剂量上并没有呈现剂量相关性，提示IgY在使用中可能并不是剂量越大越好，而是有最佳浓度。雷勇（2006）制备的抗WSSV的卵黄抗体添加到对虾基础日粮中，结果20%的卵黄添加量能够在一定程度上延缓螯虾的死亡时间，而40%的卵黄添加量则能使螯虾死亡率从100%降至30%。刘君君（2007）制备的WSSV-IgY，在对克氏螯虾攻毒保护性试验中，试验组死亡率为20%，添加有1%WSSV-IgY蛋白粉和10%的WSSV-卵黄粉组的死亡率分别降低至53.3%、67.7%。在浸泡被动免疫试验中，WSSV-IgY浸泡组的死亡率为26.7%。Lu等（2009）比较了抗WSSV的IgY和DNA疫苗的免疫保护效果，显示IgY能够有效保护小龙虾，无论是在使用IgY前，还是使用IgY后接种WSSV后，都能有效保护小龙虾，死亡率仅为20%，显著低于疫苗组的80%。

5 结语

近年来，卵黄抗体作为潜在的饲料添加剂发展较为迅速，目前已经有相关产品问世。研究表明，饲喂含有抗犬细小病毒、狂犬病、传染性肝炎、犬副流感、犬冠状病毒的卵黄抗体的饲料，可以有效降低断奶幼犬腹泻、血便和呼吸道等疾病，提高幼犬的成活率。但卵黄抗体作为添加剂进行大规模的应用还存在一定的问题，如特异性菌株的选择问题，卵黄抗体的稳定性保护和贮存、污染防治等问题，但是可以预见，其在饲料添加剂中可能具有很好的前景。

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