鸭MCHR2的基因克隆及蛋白表达鉴定

朱 勇，汪长东，刘革力，袁成福，卜友泉，易发平，焦庆昉，艾 青，刘 竹，兰 欢，武向梅，宋方洲，胡平生，Tomas Hokfelt

(1.重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心，生物化学与分子生物学教研室，重庆 400016; 2.Karolinska Institutet，Stockholm，Sweden SE-11276/S-17177)

随着人们生活水平的不断提高，饮食条件的巨大改善，肥胖症的发病率在全世界呈逐年快速上升的趋势，特别是在高速发展的中国。肥胖症作为一种营养代谢性疾病，是心脑血管疾病、糖尿病、高血压、高脂血症以及癌症等多种疾病的高危因素，现已成为一个全球性的健康问题。多年来的研究发现［1－2］下丘脑作为摄食中枢所分泌的多种神经肽物质与肥胖的发生有着密切的关系。其中，黑色素浓集激素(melanin-concentrating hormone，MCH)作为一种能增强食欲的神经肽，从发现之日起，就受到了大家的广泛关注。随着研究的逐步深入，相继发现了MCH的两个受体亚型——MCHR1和MCHR2，从而为肥胖发生机制的研究以及防治提供了新的靶点。目前，通过成功构建转基因和基因敲除动物模型，对MCH及MCHR1受体与肥胖之间的关系进行了较为深入的研究，而对于MCHR2的研究则较为缓慢，功能也尚不明确。其主要的研究瓶颈在于无法找到合适的动物模型用于MCHR2功能的研究。国内外大量报道均证明，MCHR2在大鼠、小鼠等啮齿类动物中无表达。为此，本研究扩大了MCHR2表达动物的筛选范围，通过 RT-PCR及Western blot证明了鸭脑组织中，MCHR2在mRNA水平和蛋白水平都是具有较高表达，为进一步构建MCHR2研究的动物模型提供了实验依据。这一结果在国内外尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与试剂 正常鸭、Wista鼠、SD鼠、C3H10鼠、C57鼠、犬、羊、猪由重庆医科大学动物中心提供;总RNA提取试剂盒为天根公司产品;RT-PCR试剂盒、PCR扩增试剂盒为TaKaRa公司产品;兔抗人MCHR2抗体为A bcam公司产品;HRP标记的兔抗羊IgG为北京鼎国公司产品;真核表达人MCHR2的重组质粒DNA为本实验室前期已构建。所需引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.1.2 引物设计与合成 登录 GenBank查询人、猴、犬、白鼬MCHR2基因的序列(序列号分别为:AY562946、AF513989、AY112659、AY112899)，经 Primer premier 5.0软件进行序列对比后设计合成引物，由上海生工生物技术有限公司合成。扩增MCHR2基因的全长cDNA片段(1023 bp)的上游引物:5'-ATGAATCCATTTCATGCATCTTG-3';下游引物:5'-CCCATATTGTTGATTTCCTTCTC-3'。

1.2 方法

1.2.1 动物脑组织总RNA的提取及RT-PCR反应 正常鸭、Wista鼠、SD鼠、C3H10鼠、C57鼠、狗、羊、猪脑组织经取出后立即置于预冷的研钵，将组织经液氮充分研磨成粉，按天根公司总RNA提取试剂盒说明书获得总RNA提取液，并通过琼脂糖凝胶电泳和测定吸光度值判断总RNA的质和量。按天根公司 RT-PCR试剂盒说明书逆转录为 cDNA。PCR反应条件为:95℃预变性 5 min;95℃ 30 s;55℃ 30 s; 72℃ 1 min;35个循环;72℃ 10 min;1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 动物脑组织和HeLa细胞蛋白的提取及 Western blot鉴定 取正常鸭、狗、羊、猪脑组织和处于对数生长期HeLa细胞，按蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。取40 μg处理的蛋白样品进行 SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温振荡封闭1 h，与1∶1 000稀释的羊抗 MCHR2一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜 3次，每次10 min，与 HRP标记的的兔抗羊 IgG二抗(1∶10 000稀释)室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次 10 min，发光，暗室显影。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增MCHR2全长CDNA 见Fig 1。

Fig 1 Analysis of MCHR2 expression in brain tissue of animals by RT-PCR

2.2 MCHR2蛋白在动物脑组织中的表达 Western印迹检测结果如Fig 2所示:在鸭脑组织中检测到 MCHR2在蛋白水平具有较高表达，在犬海马及皮质区MCHR2也有一定表达，而在猪海马区和皮质区MCHR2分别是低表达的和无表达的。

Fig 2 Identification and analysis of MCHR2 protein by Western blot

2.3 MCHR2蛋白在鸭脑组织和 HeLa细胞中的表达Western印迹检测MCHR2蛋白在鸭脑组织中的表达情况并以HeLa细胞蛋白为对照。结果如Fig 3所示:MCHR2蛋白在鸭脑组织中的确具有高表达，重复了Fig 2中的结果;而对照组HeLa细胞中则无MCHR2蛋白的表达。

Fig 3 Identification and analysis of MCHR2 protein in duck brain tissue by Western blot

3 讨论

MCH是一类由下丘脑分泌的能促进食欲的神经肽物质，其在体重调节和能量代谢方面起着重要作用。Ludwig等［3］通过直接在脑室内注射 MCH刺激大鼠及小鼠食物摄入增加，引起体重增长，最终导致肥胖。该研究小组随后建立了过度表达MCH的转基因小鼠，发现小鼠摄食增加，并产生了高脂蛋白血症、高血糖及胰岛素抵抗。而Shimada等［4］则通过建立MCH敲除小鼠，发现小鼠进食减少、消瘦，并出现了代谢率增加。MCH生物学功能和两个 G蛋白偶联受MCHR1和MCHR2密切相关［5－7］。MCHR1与 MCHR2分别由353和340个氨基酸残基组成，都是有7个跨膜α螺旋的G蛋白偶联受体超家族(GPCRs)I类成员，两个受体具有38%的同源性［8］。MCHR1在啮齿类及多种高等动物体内均有表达，其主要分布于大脑皮质层、丘脑、下丘脑、海马、杏仁核及苍白球。MCHR2则主要分布于大脑皮质、海马、下丘脑腹侧、杏仁核及屏状核等区域，并且目前发现MCHR2仅在人、恒河猴、犬、白鼬中有表达，而在啮齿类动物中无表达［9］。两种受体的分布区域与摄食行为、能量代谢、情绪调节密切相关。Chen等［10］通过建立 MCHR1基因敲出小鼠(MCHR1-/-mice)发现小鼠消瘦，但是进食增多，推测其消瘦是由于运动量增大导致能量代谢率增高而引起的。而MCH-/-小鼠出现消瘦是则由于进食减少和代谢增高而引起。从这两者引起小鼠消瘦原因的差异，推断可能是MCHR2在进食及能量代谢方面发挥着重要的调节作用，所以弄清MCHR2在体重调节和能力代谢等方面的作用以及分子机制显得尤为重要。目前对MCHR1的研究比较透彻，而对于MCHR2的研究，由于受到动物模型构建的局限性，进展得非常缓慢。因此，能否突破构建动物模型的瓶颈，成为进行MCHR2体内水平研究的重要因素。

本实验室基于前期对MCHR2相关表达及功能分析的基础上［11］，拟构建稳定表达MCHR2基因的动物模型，观察其进食行为、体重及新陈代谢的变化，以探明该受体可能的生理功能，为肥胖症的防治研究提供新的靶点。但据文献报道目前 MCHR2只在人、恒河猴、犬、白鼬有表达，而在啮齿类动物如:在大鼠、小鼠和仓鼠等中无表达。为了找到能够稳定表达MCHR2的动物以构建动物模型，我们从大鼠、小鼠、犬、羊、猪、鸭等脑组织中提取总 RNA和蛋白质，用 RTPCR和Western blot的方法检测MCHR2在上诉几种动物中的表达情况。人 MCHR2 cDNA全长为1 023 bp，编码具有340个氨基酸的蛋白质，我们先以人的MCHR2基因的全长cDNA编码序列进行比对后设计引物，采用RT-PCR方法扩增上诉动物脑组织中的MCHR2全长cDNA片段。RT-PCR的结果显示SD鼠、Wista鼠、C3H10小鼠、C57小鼠未出现目的条带，而在鸭、犬、猪3组中出现了长约1 023 bp的目的片段;同时还证明了MCHR2基因在羊中并无表达。RT-PCR的结果一方面印证了文献报道中MCHR2在大鼠、小鼠等啮齿类动物中无表达的结论;另一方面也证实了MCHR2在犬中是有一定表达的;除此之外，我们发现MCHR2在猪脑组织中有一定表达，但相对较弱;而在鸭脑组织中则具有较高表达。随后，我们分别提取犬和猪脑组织皮质区和海马区蛋白以及鸭脑组织蛋白检测MCHR2在蛋白水平的表达情况。结果显示，MCHR2蛋白在鸭脑组织中具有很高的表达，在犬海马区和皮质区均具有一定的表达(海马区表达高于皮质区)，而在猪海马中表达较低，在猪脑皮质区则完全没有表达。单独检测MCHR2在鸭脑组织中的表达，得到了同样的结果。自此，我们通过 RT-PCR和Western blot分别从转录水平和蛋白水平分析鉴定了MCHR2在犬和鸭体内具有稳定的表达，而在猪体内由于表达量较低，其是否能够稳定表达还需实验进一步证实。MCHR2在犬脑组织中表达早已有文献报道，而在鸭脑组织中的高表达则是由本实验组首次报道。由于MCHR2在大鼠、小鼠等啮齿类动物中无表达，而相比犬、猴等大型动物，鸭体积较小，容易进行实验处理和观察，这使得将鸭作为MCHR2基因表达及相关功能研究的动物模型具有了可能性，但是否具有切实可行性，还需进行相关的预实验进一步论证。

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