表达ApxIA的血清7型胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株的构建及特性分析

刘金林，陈砚，胡琳琳，贝为成，陈焕春

1 华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070

2 华中师范大学生命科学学院，武汉 430079

胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 (Actinobacillus pleuropneumoniae，APP) 为革兰氏阴性杆菌，目前该菌共有15个血清型[1]，除血清13和14型细菌生长为不依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD) 的生物Ⅱ型外，其余13种血清型菌均为依赖NAD生长的生物I型，并都与猪致病相关。APP可引起猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)，在世界各国均有发生，给全球养猪业带来巨大经济损失[2]。抗生素在预防和控制细菌性传染病上曾起到很大作用，但随着耐药菌株的频繁出现以及国家对抗生素使用的严格限制，疫苗将成为控制猪传染性胸膜肺炎的主要手段。目前所使用的疫苗主要是全细菌灭活疫苗或亚单位疫苗。由于APP血清型多，各血清型之间交叉保护率较低，大大增加了防治该病的难度[3]。近年来，胸膜肺炎放线杆菌减毒活疫苗的研究，为该病的防治带来新希望[4-6]。可以预见，应用新型安全、高效的基因缺失疫苗将成为控制猪传染性胸膜肺炎的一种趋势。由于血清 7型胸膜肺炎放线杆菌不分泌毒素 ApxI仅分泌毒素 ApxII，而毒素 ApxI和毒素ApxII既是APP两个主要的毒力因子，同时又是作为APP两个关键的免疫保护性蛋白，因此，拟通过本研究探索提高胸膜肺炎放线杆菌弱毒疫苗免疫原性的途径，同时可以通过该系统表达其他呼吸系统病原的重要免疫原，为呼吸系统疾病的预防与控制提供新方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+) 购自美国Sigma公司。各种限制性内切酶、LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、pMD18-T载体购自大连宝生物工程(大连) 有限公司。DNA凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。胰蛋白大豆琼脂 (Tryptic soy agar，TSA)、胰蛋白大豆肉汤 (Tryptic soy broth，TSB) 购自美国Difco公司。

1.1.2 菌株与质粒

胸膜肺炎放线杆菌血清7型apxIIC-基因缺失弱毒疫苗菌株HB04C-由本实验室贝为成博士构建并保存[7]。血清1型胸膜肺炎放线杆菌SLW01为本实验室分离并保存。大肠杆菌Escherichia coli DH5α由本实验室保存。穿梭质粒pJFF224-XN由瑞士伯尼尔大学Joachim Frey教授惠赠[8]。

1.1.3 引物

引物设计见表1。

1.1.4 实验动物

6~8周龄仔猪购自湖北省某大型猪场，胸膜肺炎放线杆菌血清学和病原学检测均为阴性。

1.2 方法

1.2.1 APP基因组制备及apxIA基因扩增

取血清1型APP分离株SLW01的新鲜培养物，根据文献[10]描述的方法提取APP基因组。以基因组为模板，通过引物P1和P2为扩增到apxIA基因。扩增条件为：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 1 min ，55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，共30个循环；然后72℃延伸10 min。

表1 本研究所用引物及说明Table 1 Primers used in this study

1.2.2 穿梭质粒的构建

将前述PCR产物apxIA基因连接到pMD18-T载体，得到质粒pMD-apxIA，经酶切鉴定正确后，以Pst I/Not I双酶切，回收apxIA片段并连接到经同样酶切的穿梭质粒 pJFF224-XN中，得到携带外源基因的穿梭质粒pJFF-IA。

1.2.3 突变株的筛选

大量制备质粒pJFF-IA，以电转化将重组穿梭质粒pJFF-IA转化胸膜肺炎放线杆菌弱毒株HB04C-。胸膜肺炎放线杆菌电转化感受态的制备以及电转化条件参考文献[7]进行。经过氯霉素抗性筛选，得到氯霉素抗性的菌株，再以PCR (引物P3/P4) 加以验证。将得到的突变株命名为 HB04C2 (apxIIC−/ apxIIA+/apxIA+)。

1.2.4 HB04C2的遗传稳定性分析

将得到的重组菌HB04C2分别在含有氯霉素抗性的TSA培养基和不含抗性的TSA培养基上传20代，每代细菌均取样，用引物P3/P4 PCR鉴定，以确定HB04C2的遗传稳定性。

1.2.5 HB04C2分泌性外毒素的检测

首先提取亲本菌和重组菌株天然毒素[11]，然后以本实验室制备的抗ApxIA的单克隆抗体为一抗，进行Western blotting检测[12]。

1.2.6 HB04C2的增殖能力分析

将过夜培养的HB04C-和HB04C2分别以1:1000比例接种到100 mL TSB培养基 (含NAD和10%小牛血清)，接种后每隔1 h取样，测定菌液在600 nm下的吸光值，共计10 h，重复3次取平均值。比较2个菌株的增长能力。

1.2.7 HB04C2对仔猪的免疫保护性研究

选取10头健康仔猪 (6~8周龄，APP病原学血清学均为阴性)，随机分为2组，每组5头。将HB04C2 (活菌含量1×108CFU) 通过气管接种免疫第一组仔猪，间隔2周，以同样方式加强免疫，第二组仔猪接种TSB作为阴性对照。在一免前、二免前以及攻毒前通过前腔静脉采血，用本实验室建立的ApxI-ELISA、ApxII-ELISA检测方法检测毒素ApxIA、ApxIIA抗体[13-14]。第2次免疫2周后，连同TSB对照，用血清1型APP分离菌株SLW01 (活菌含量1×108CFU)通过气管注射对仔猪进行攻毒，观察攻毒后仔猪的状态，并于7 d后将存活猪处死观察剖检病变。仔猪临床症状指数 (Clinical sign score) 的评定参考Tumamao等[15]描述的标准：0=无症状；1=呼吸频率增加；2=腹式呼吸；3=咳嗽；4=呼吸困难；5=死亡。按照Hannan等[16]描述的方法评价仔猪肺部损伤情况：即将整个肺分成7个部分，按肺部病变程度给每部分评分，每部分的最高分为5分，损伤越大，分值越高，各部分分数之和作为肺部损伤指数 (Lung lesion score)。

2 结果

2.1 穿梭质粒pJFF-IA的构建

PCR扩增的apxIA基因产物克隆到pMD18-T载体中，序列分析证实无碱基误配。经Pst I和Not I酶切apxIA并插入到穿梭质粒pJFF224-XN的T4启动子下游。构建的重组质粒经Pst I和Not I双酶切后得到2条约为7000 bp和3000 bp的片段，表明质粒构建正确 (图1)。

2.2 穿梭质粒pJFF-IA的电转化及HB04C2的筛选

通过高效电穿孔方法将穿梭质粒pJFF-IA转化到HB04C-。通过氯霉素抗性筛选，得到阳性克隆，以apxIA N端特异性引物P3和P4进行PCR扩增，可得到826 bp特异片段，而亲本菌HB04C-为阴性(图略)。

图1 重组质粒pJFF-IA的酶切鉴定Fig. 1 Identification of pJFF-IA by enzyme digestion. M: DNA ladder 15 000; 1: pJFF-IA digested with Not I/Pst I.

2.3 HB04C2的生物学特性

HB04C2在含氯霉素培养基和不含氯霉素培养基连续传代后，都能扩增出apxIA N端826 bp特异片段 (图略)，表明穿梭质粒pJFF-IA在APP菌株HB04C2中能够稳定传代。提取重组菌HB04C2和亲本菌HB04C-的分泌性蛋白，用抗ApxIA单克隆抗体作为一抗进行Western blotting检测，结果显示重组菌HB04C2在110 kDa处出现一条特异性带，与预期的分子量相当 (图2)，但同时发现另有一条略小的杂交带，笔者推测其可能是apxIA从469~3069 bp的表达产物 (大小约为93.8 kDa)。而亲本菌株HB04C-未出现该特异性带，结果表明稳定携带穿梭质粒pJFF-IA的基因工程重组菌株HB04C2能够表达且分泌具有免疫学活性的ApxIA。重组菌HB04C2和亲本菌HB04C-的生长曲线如图3所示。可见重组菌和亲本菌生长能力差别不大，表明携带穿梭质粒并没有明显影响APP的生长速度。

图2 SDS-PAGE (A) 和Western blotting (B) 检测重组菌株ApxIA的表达Fig. 2 Detection of ApxIA secreted by HB04C2. (A) SDS-PAGE. (B) Western blotting. 1: HB04C2; 2: HB04C-.

图3 HB04C2体外增殖能力分析Fig. 3 Growth ability of attenuated A. pleuropneumoniae strains in vitro.

2.4 HB04C2的免疫原性研究

2.4.1 免疫仔猪血清学检测

结果显示，经气管接种HB04C2后，在14 d可以检测到ApxIA和ApxIIA的抗体，到首免后28 d，抗体提高很多 (图 4)，与对照组比较差异均极显著(P<0.01)，对照组的仔猪在整个试验过程血清抗体均呈阴性。

2.4.2 攻毒保护效果

对照组仔猪在攻毒后表现出厌食、喘气、呼吸极度困难，有的口吐白沫等传染性胸膜肺炎临床症状，攻毒后24 h内全部死亡，解剖后可见肺部严重出血。气管免疫组仔猪在攻毒后，当天表现嗜睡、喘气，但攻毒2 d后基本恢复正常；解剖只有1头仔猪肺局部有出血点，其余4头正常。免疫组的肺损伤指数显著低于对照组 (P<0.01) (表 2)。结果表明，HB04C2能提供给仔猪对异源血清1型APP攻击的有效保护。

图4 仔猪血清抗体检测Fig. 4 Evaluation of antibodies against ApxIA (A) and ApxIIA (B). * P < 0.01 compared with the TSB group.

表2 HB04C2免疫动物的攻毒保护结果Table 2 Protection of pigs against challenge with heterologous virulent A. pleuropneumoniae serovar 1

3 讨论

胸膜肺炎放线杆菌是猪传染性胸膜肺炎的致病菌，该病是一种急性或慢性呼吸道疾病，以肺部出血性、纤维素性和坏死性肺炎为特征，具有高度的传染性，各种年龄的猪均可感染发病，对养猪业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫可预防APP的感染，而弱毒疫苗则以其高效和可诱导交叉保护的特点吸引着诸多研究者的目光。随着分子生物学发展及APP分子致病机理研究的深入，利用现代分子生物学技术和基因工程方法，通过失活毒力相关因子，构建低毒力甚至无毒力APP基因工程弱毒活疫苗菌株，成为目前猪传染性胸膜肺炎疫苗研究的热点领域。

APP共有4种RTX毒素，分别为ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV。其中ApxI有强的溶血活性和强细胞毒性，ApxII的溶血活性和细胞毒性都相对较弱，ApxIII无溶血活性，但有强的细胞毒性[17]。除ApxIV在所有血清型APP都存在外，每种血清型APP最多只含ApxI、ApxII、ApxIII中的两种[17-18]。同时含有ApxI和ApxII的菌株表现为高致病性。本研究选用本实验室构建的apxIIC基因缺失菌株HB04C-为亲本菌株，是因为先前已对该基因缺失菌株的安全性、免疫原性和诱导动物的免疫保护率都有了全面的研究[7,19]。该弱毒菌株免疫动物能完全抵抗同源血清7型APP的攻击，但对毒力最强的异源血清1型APP的保护率只有70%，因为该弱毒菌株不能产生重要的保护性抗原ApxIA。为了提高HB04C-对异源血清1型APP的保护率，增强该菌株的免疫效力，本研究使用穿梭质粒，可以在 HB04C-中稳定表达ApxIA，且血清7型APP中含有apxIB/apxID基因，可以为ApxIA的分泌提供通道[17]。作为APP重要的免疫原，单独免疫ApxIA天然毒素或原核表达产物[20]，或 ApxIA的部分片段[21]，或是某些抗原表位[22]，均可产生较好的保护效果。经气管免疫HB04C2后，可诱导仔猪产生针对ApxIA的抗体，表明重组菌株产生的ApxIA具有良好的免疫原性，经过加强免疫后，ApxIA抗体水平显著提高，表明该表达系统具有较高的表达活性，外源基因的表达产物可刺激动物产生显著的免疫应答反应。以强毒血清1型APP攻击后，空白对照组表现严重的胸膜肺炎症状并死亡，免疫组仔猪表现为轻微或中等程度的临床症状，但于观察期内恢复正常，重组菌株对致死性剂量的强毒菌株的攻击提供了完全保护，表明该菌株具有较好的交叉保护能力。

本实验中免疫方式为气管注射免疫，其操作难度较大，易对仔猪造成应激，而且在注射部位及周边组织会水肿等问题。本实验室曾尝试采用滴鼻免疫，可以达到较好的免疫效果[23]。有资料显示，可通过密闭的气雾发生装置，让动物吸入携带APP的气溶胶来进行接种，能达到较好的感染效果[24]。因此，对于弱毒疫苗在规模化养殖场中的推广应用，采用气雾免疫或滴鼻免疫的方式可能会更加适用，但这些方法的广泛应用，还需要一段时间的探索。

虽然穿梭质粒本身携带的抗生素抗性基因产生的食品安全隐患，有待进一步改善，如构建无抗生素基因的平衡致死系统。ApxIA的血清7型APP菌株的构建及特性分析，为今后开发以APP弱毒菌株为载体的呼吸系统疾病的新型多价疫苗以及研究APP的基因功能奠定了基础。

REFERENCES

[1] Blackall PJ, Klaasen HL, van Den BH, et al. Proposal of a new serovar of Actinobacillus pleuropneumoniae: serovar 15. Vet Microbiol, 2002, 84(1/2): 47–52.

[2] Fenwick B, Henry S. Porcine pleuropneumonia. J Am Vet Med Assoc, 1994, 204(9): 1334–1340.

[3] Higgins T, Lariviere S, Mittal KR, et al. Evaluation of a killed vaccine against porcine pleuropneumonia due to Haemophilus pleuropneumonia. Can Vet J, 1985, 26(2): 86–89.

[4] Rosendal S, MacInnes JI. Characterization of an attenuated strain of Actinobacillus pleuropneumoniae, serotype 1. Am J Vet Res, 1990, 51(5): 711–717.

[5] Inzana TJ, Todd J, Veit HP. Safety, stability, and efficacy of noncapsulated mutants of Actinobacillus pleuropneumoniae for use in live vaccines. Infect Immun, 1993, 61(5): 1682–1686.

[6] Fuller TE, Thacker BJ, Duran CO, et al. A genetically–defined riboflavin auxotroph of Actinobacillus pleuropneumoniae as a live attenuated vaccine. Vaccine, 2000, 18(25): 2867–2877.

[7] Bei W, He Q, Yan L, et al. Construction and characterisation of a live, attenuated apxIICA inactivation mutant of Actinobacillus pleuropneumoniae lacking a drug resistance marker. FEMS Microbiol Lett, 2005, 243(1): 21–27.

[8] Frey J. Construction of a broad host range shuttle vector for gene cloning and expression in Actinobacillus pleuropneumoniae and other Pasteurellaceae. Res Microbiol, 1992, 143(3): 263–269.

[9] Chen F, Chen ML, Chen HC, et al. Development of genotyping system for Actinobacillus pleuropneumoniae and its clinical application. Acta Mcrobiol Sin, 2004, 44(5): 679–682.陈凡, 陈美玲, 陈焕春, 等. 胸膜肺炎放线杆菌基因分型方法的建立及其临床应用. 微生物学报, 2004, 44(5): 679–682.

[10] Prideaux CT, Pierce L, Krywult J, et al. Protection of mice against challenge with homologous and heterologous serovars of Actinobacillus pleuropneumoniae after live vaccination. Curr Microbiol, 1998, 37(5): 324–332.

[11] Nielsen R, van den Bosch JF, Plambeck T, et al. Evaluation of an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to the Apx toxins of Actinobacillus pleuropneumoniae. Vet Microbiol, 2000, 71(1/2): 81–87.

[12] Huang H, Zhou R, Fan H, et al. Generation of monoclonal antibodies and epitope mapping of ApxIVA of Actinobacillus pleuropneumoniae. Mol Immunol, 2006, 43(13): 2130–2134.

[13] Liu J, He Q, Chen H, et al. Cloning, expression of apxI gene of Actinobacillus pleuropneumoniae and development of ELISA. Sci Agric Sin, 2003, 5(2): 578–582.

[14] Liang WW, He QG, Liu ZF, et al. Cloning and expreesion of ApxII and development an indirect ELISA for detection of antibody against A. pleuropneumoniae. Chin J Vet Sci, 2005, 25(2): 145–147.梁旺望, 何启盖, 刘正飞, 等. 胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxII蛋白的表达, 纯化及其间接ELISA检测方法的建立与应用. 中国兽医学报, 2005, 25(2): 145–147.

[15] Tumamao JQ, Bowles RE, van den Bosch H, et al. Comparison of the efficacy of a subunit and a live streptomycin-dependent porcine pleuropneumonia vaccine. Aust Vet J, 2004, 82(6): 370–374.

[16] Hannan PC, Bhogal BS, Fish JP. Tylosin tartrate and tiamutilin effects on experimental piglet pneumonia induced with pneumonic pig lung homogenate containing mycoplasmas, bacteria and viruses. Res Vet Sci, 1982, 33(1): 76–88.

[17] Frey J. Virulence in Actinobacillus pleuropneumoniae and RTX toxins. Trends Microbiol, 1995, 3(7): 257–261.

[18] Schaller A, Kuhn R, Kuhnert P, et al. Characterization of apxIVA, a new RTX determinant of Actinobacillus pleuropneumoniae. Microbiology, 1999, 145(8): 2105–2116.

[19] Bei W, He Q, Zhou R, et al. Evaluation of immunogenicity and protective efficacy of Actinobacillus pleuropneumoniae HB04C-mutant lacking a drug resistance marker in the pigs. Vet Microbiol, 2007, 125(1/2): 120–127.

[20] Yan KX, Liu JJ, Zhou R, et al. Acute toxicity and immunoprotection of recombinant ApxI toxin of Actinobacillus pleuropneumoniae in mice. Chin J Biotech, 2006, 22(1): 65–70.严克霞, 刘建杰, 周锐, 等. 重组胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxI对小鼠的急性毒性和免疫保护性研究. 生物工程学报, 2006, 22(1): 65–70.

[21] Mei L, Zhou R, Lu HS, et al. Study on immunogenicity of the N terminal polypeptide of RTX toxin I of Actinobacillus pleuropneumoniae. Chin J Biotech, 2006, 22(1): 40–45.梅岭, 周锐, 卢海松, 等. 猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型RTX毒素I的N端表达多肽具有良好的免疫原性. 生物工程学报, 2006, 22(1): 40–45.

[22] Bagdasarian MM, Nagai M, Frey J, et al. Immunogenicity of Actinobacillus ApxIA toxin epitopes fused to the E. coli heat-labile enterotoxin B subunit. Vaccine, 1999, 17(5): 441–447.

[23] Lin L, Bei W, Sha Y, et al. Construction and immunogenicity of DeltaapxIC/DeltaapxIIC double mutant of Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 1. FEMS Microbiol Lett, 2007, 274(1): 55–62.

[24] Jacobsen MJ, Nielsen JP, Nielsen R. Comparison of virulence of different Actinobacillus pleuropneumoniae serotypes and biotypes using an aerosol infection model. Vet Microbiol, 1998, 49(3/4): 159–168.