不同结构大豆皂甙对人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖抑制作用

陈兰兰,罗海吉,查龙应

(南方医科大学公共卫生与热带医学学院营养与食品卫生学系,广州510515)

大豆除了含有优质蛋白质之外,还含有丰富的生物活性物质[1],其中大豆皂甙(soyasaponin,SS)是由萜类同系物与糖缩合形成的一类化合物(五环三萜类糖甙),主要分为 A、B、E和DDM P类皂甙[2]。SS具有抗癌、抗突变以及抗氧化等作用,其中,SS的抗癌作用尤为引人关注。有研究表明,SS对肝癌、结肠癌、乳腺癌、皮肤癌以及前列腺癌等都具有抑制作用[3-6]。近来研究表明,SS的抑癌效果因其结构而异[5,7]。SS经肠道细菌糖苷酶水解后产生相应的代谢产物大豆皂醇(soyasapogeno l,SG),主要包括SG-A、SG-B和SG-E,SG的生理活性与SS不同[5]。本文主要研究大豆总皂甙(total soyasaponin,TS)、SG-A和SG-B对人肝癌细胞株H epG2细胞的增殖抑制作用,探讨其抑癌效果的差异。

1 材料与方法

1.1 材料 TS购自华北制药股份有限公司,纯度为80%;人肝癌细胞株HepG2细胞株购自中科院上海生化细胞所;噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)和胰蛋白酶购自美国Sigma公司;DM EM高糖培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Gibco公司;EPICU Elite流式细胞仪购自美国Beckman-coulter公司;Annexin V-FITC/PI双染凋亡试剂盒购自北京创根胜泰科技有限公司;ELX-808酶标分析仪购自美国Bio-Tek公司。

1.2 研究方法

1.2.1 SG制备 参考Gurfinkel等[8]方法,用甲醇溶解TS后,加入浓硫酸进行热水解,经Sep-Pak C18固相萃取柱进行分离制备SG-A和SG-B,纯度分别为57.3%和 62.6%。

1.2.2 细胞增殖抑制实验 HepG 2细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基于25 cm2培养瓶中进行培养和传代,将处于对数生长期的细胞按1×104/m L密度接种于96孔细胞培养板,每孔200μL,在 37℃、5%CO2孵箱中培养 24 h,细胞贴壁后,加入不同浓度(10～400μg/m L)的SS(SG-A、SG-B和TS),同时设不加药物的阴性对照和不接种细胞的空白对照。继续培养24、48、72 h,每个浓度每个时间点设置 6个重复孔。在每个时间点结束时于每孔培养板中加入20μL MTT,孵育4 h后小心吸去上清液,每孔加入200μL DMSO后用酶标仪测定490 nm波长处吸光值(A),实验重复3次。细胞增殖抑制率按以下公式计算:抑制率=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。

1.2.3 细胞凋亡检测 收集阴性对照组和400μg/m L SG-A、SG-B和 TS分别作用于24、48、72 h后的细胞,按 Annexin VFITC/PI双染凋亡试剂盒说明用流式细胞仪(美国EPICU Elite Beckman-coulter)进行细胞凋亡检测。

1.3 统计学方法 用SPSS11.5统计软件对数据进行单因素方差分析,结果以±s表示,以P＜0.05为差异有统计学意义,用SPSS11.5的 Probit程序计算细胞增殖半数抑制浓度(IC50)。

2 结 果

2.1 SS对HepG2细胞增殖的影响 不同结构SS对HepG2细胞增殖抑制率呈现时间和浓度依赖性,随时间的延长和浓度的增加,抑制细胞增殖的效果更明显。SG-B和SG-A对细胞增殖的抑制效果较 TS明显,见表 1。

表1 不同结构SS对H epG 2细胞的增殖抑制率(±s,%)

表1 不同结构SS对H epG 2细胞的增殖抑制率(±s,%)

同一时间同一浓度时,不同上标字母(a,b,c)表示差异有统计学意义。

浓度(μg/m L)24 h 48 h 72 h SG-A SG-B TS SG-A SG-B TS SG-A SG-B TS 10 5.3±0.6a 5.4±0.3a 4.0±0.2b 8.1±0.9 7.2±0.4 6.5±0.4 9.5±0.4a 8.3±0.5b 7.4±0.1c20 7.5±0.6a 8.8±0.6b 6.7±0.1a 10.5±0.7 11.2±1.1 10.1±0.4 12.3±0.3a11.7±0.6a 9.5±0.4b40 8.2±0.7a10.3±0.5b 7.6±0.4a 12.0±0.5a14.4±0.5b11.2±0.9a 14.0±0.7a17.0±0.5b13.2±0.6a80 10.7±0.1a12.5±0.7b 8.8±0.2c 14.9±0.3a17.3±0.4b14.1±0.8a 17.2±0.8a18.6±0.6b15.1±0.6c100 11.5±0.6a15.0±0.3b11.1±0.7a 16.4±0.6a20.0±0.6b15.9±0.2a 22.9±0.7a26.0±0.4b19.2±0.6c160 13.9±0.9a18.6±0.6b12.6±0.6a 19.6±0.6a24.4±0.3b17.4±0.4c 27.4±1.0a31.8±2.0b22.7±0.9c200 19.1±0.5a21.7±1.4a16.2±0.2b 24.2±0.4a27.7±0.9b19.7±0.4c 34.3±1.4a39.4±1.1b27.2±0.6c400 22.9±2.0a24.5±0.6a18.5±1.5b 30.2±1.5a30.7±0.6a21.4±0.3b 37.4±1.9a48.2±1.4b31.3±1.7c

表2 不同结构SS致HepG2细胞凋亡率变化(±s,%)

表2 不同结构SS致HepG2细胞凋亡率变化(±s,%)

同一时间同一浓度时,不同上标字母(a,b,c)表示差异有统计学意义。

Annexin V+/PI-Annexin V+/PI+组别合计24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h对照组 7.4±2.1d 7.8±0.9c 5.7±2.0 1.1±0.4 9.4±2.6b 14.9±2.1c 8.5±1.8d 17.1±2.4d 20.5±0.4cSG-A 组 22.0±3.0b22.2±1.4a 7.2±2.4 1.6±0.7 15.9±2.0b 26.1±4.2b 23.6±3.4b 38.1±1.7b 33.2±2.2bSG-B组 30.6±2.2a17.4±0.8b 10.5±2.9 2.0±0.5 32.4±3.3a 51.6±3.3a 32.6±2.7a 49.7±2.8a 62.1±5.4aTS组 14.0±2.5c21.1±1.6a 6.4±2.6 1.5±0.4 12.7±0.4b 16.3±1.4c 15.4±2.7c 33.8±1.9c 22.8±1.5c

图1 不同结构SS对HepG 2细胞增殖的IC50

图2 流式细胞术检测不同结构SS(400μg/m L)作用72 h后致HepG 2细胞凋亡结果

2.2 细胞增殖IC50不同结构SS作用H epG 2细胞72 h后的IC50有明显差异(图1),SG-A和 SG-B的IC50低于 TS,差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 SS对HepG2细胞凋亡的影响 SS作用H epG 2细胞后能检测到明显的细胞凋亡现象(表2)。处理24 h后,SG-A、SG-B和TS诱导的早期凋亡均显著高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),3种不同结构SS诱导早期凋亡的作用呈现差异(SG-B＞SG-A＞TS)。随着作用时间的延长,以晚期凋亡(或坏死)为主(图2)。

3 讨 论

SS的抗癌活性已得到肿瘤细胞体外培养实验[4-5]、动物实验[9]以及人群流行病学实验[9-10]的证实,但这些实验多以TS提取物开展研究,关于SS结构与抗癌活性关系的研究直到近几年才有报道[2,5,7],其主要原因在于受不同结构SS分离纯化技术的制约[1]。本实验研究了TS以及两种形式的SG-A和SG-B对HepG 2细胞的增殖抑制作用,结果发现,3种形式的SS均能有效抑制 HepG 2细胞的增殖,呈浓度和时间依赖关系,进一步分析3种SS对H epG 2细胞增殖的 IC50发现,SG-A[(0.98±0.17)mg/m L]和SG-B[(0.50±0.02)mg/m L]的IC50值显著低于 TS的IC50值[(1.96±0.51)mg/m L],差异有统计学意义(P＜0.05),表明 SG-A和 SG-B抑制 HepG2细胞的活性要强于 TS。Zhang和 Popovich[5]报道,TS、SG-A和 SG-B作用 HepG2细胞72 h后的IC50值分别为(0.594±0.021)mg/m L、(0.052±0.011)mg/m L和(0.128±0.005)mg/m L。研究表明SG-A和SG-B抑制HepG 2细胞增殖的活性高于TS,但不同的是SG-A的活性高于SG-B,这可能与SG的提取方法以及其纯度不一致有关[11]。全吉淑等[12]研究了 TS和SG(含28.2%的SG-A和41.9%的SG-B)对人结肠癌H T-29细胞增殖的抑制作用。结果同样发现,SG的抑癌活性高于TS。

细胞凋亡与肿瘤的发生、发展及退化有密切的关系[13-14],也是许多植物、化学物质抑癌活性的机制之一[15-16]。有研究表明,SS能够诱导不同类型的肿瘤细胞凋亡[3-5]。本实验用Annexin V-FITC/PI双染凋亡法检测发现,TS、SG-A和SG-B均能诱导HepG 2细胞发生凋亡,作用24 h后主要发生早期凋亡(Annexin V+/PI-),且SG-B诱导细胞早期凋亡的活性显著高于SG-A,差异有统计学意义(P＜0.05),后者则又显著高于TS,差异有统计学意义(P＜0.05)。随着作用时间的延长,细胞主要以晚期凋亡或坏死(Annexin V+/PI+)为主。

本实验结果表明,SG(SG-A和SG-B)抑制人肝癌细胞株H epG 2细胞增殖的活性高于TS,诱导细胞凋亡可能是其机制之一,且SG诱导细胞凋亡的活性同样高于TS。同时,SG-A和SG-B诱导细胞凋亡的活性也有差异,其诱导细胞凋亡的信号通路调控机制有待于进一步研究。此外,SG为SS的肠道分解产物,而肠道微生物菌群是否会影响SS的分解代谢,并进而影响SS抗癌活性的效果尚需进一步研究。

[1]Guclu-UstundaO,Mazza G.Saponins:p roperties,app lications and p rocessing[J].Crit Rev Food Sci Nutr,2007,47(3):231.

[2]Hu J,Reddy M B,Hendrich S,et al.Soyasaponin I and Sapongeno l B have limited absorp tion by Caco-2 intestinal cells and limited bioavailability in w omen[J].J Nutr,2004,134:1867.

[3]Fournier DB,Erdman JW,Gordon GB.Soy,its components and cancer p revention:a review of the in vitro,animal,and human data[J].Cancer Epidemiol Biomark Prev,1998,7:1055.

[4]Xiao JX,Huang GQ,Zhang SH.Soyasaponins inhibit the p roliferation of Hela ce lls by inducing apop tosis[J].Exp Toxico l Patho l,2007,59:35.

[5]Zhang W,Popovich DG.Effect of soyasapogenol A and

soyasapogenol B concentrated extrac ts on Hep-G2 cell proliferation and apoptosis[J].JAgric Food Chem,2008,56:2603.

[6]Ellington AA,Berhow MA,Singletary KW.Induction of macroautophagy in human colon cancer cells by soybean B-group triterpenoid saponins[J].Carcinogenesis,2005,26(1):159.

[7]Gurfinkel DM,Rao AV.Soyasaponins:the relationship between chem ical structure and colon anticarcinogenic activity[J].Nutr Cancer,2003,47(1):24.

[8]Gurfinkel DM,Reynolds WF,Rao AV.The iso lation of soyasaponins by fractional precipitation,solid phase extraction and low pressure liquid chromatography[J].Int J Food Sci Nutr,2005,56(7):501.

[9]Bennink MR.Dietary soy reduces co lon carcinogenesis in human and rats,soy and colon cancer[J].Adv Exp Med Biol,2001,492:11.

[10]Rao AV,Sung MK.Saponins as anticarcinogens[J].JNutr,1995,125:717.

[11]Zhang W,Yeo MC,Tang FY,etal.Bioactive responses of Hep-G2 cells to soyasaponin extracts differs with respect to ex traction conditions[J].2009,47:2202.

[12]全吉淑,徐俊萍,许惠仙,等.大豆皂甙及甙元抗结肠癌作用的实验研究[J].食品科技,2009,34(2):176.

[13]李青国,陈龙舟,周士福.新辅助化疗对乳腺癌细胞凋亡和增殖的影响[J].重庆医学,2009,38(1):58.

[14]姜果,张建华,姜荣健,等.膀胱移行细胞癌 survivin表达临床特征及与肿瘤细胞增殖和凋亡的关系[J].重庆医学,2006,35(16):1468.

[15]Melet A,Song K,Bucur O,et al.Apop totic pathw ays in tumor p rogression and therapy[J].Adv Exp M ed Bio l,2008,615:47.

[16]刘晓春,蓝娇,潘莉莉,等.芸朵甙诱导鼻咽癌 CNE2细胞凋亡及其对细胞内钙含量的影响[J].广西医学,2009,31(5):616.