诱导性多能干细胞的研究进展及应用前景

林晓龙，姜桦，陈彤

干细胞治疗被认为是21 世纪治疗人类疾病最理想的模式。根据分化潜能的不同，干细胞可以分为全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞；根据来源的不同，干细胞可分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES 细胞）和成体干细胞。经过几十年的研究，科学家在 ES 细胞分离、纯化、体外培养、遗传操作等方面已积累了相当丰富的经验，目前可通过囊胚内细胞团分离、核转移、细胞融合等多种方法获得ES 细胞，ES 细胞所具有的多向分化潜能和无限增殖的能力使它拥有广阔的基础及临床应用前景。但是，ES 细胞建系过程中需要破坏受精卵或囊胚，在许多国家和民族的宗教信仰中，受精卵或囊胚即是生命，因此，伦理问题成为胚胎干细胞研究无法逾越的障碍；此外，从 ES 细胞中获得的功能细胞对患者来说属于异体细胞，细胞治疗时的免疫排斥问题也阻碍了它的临床研究进展；加上细胞培养过程的繁琐、定向分化能力的非可控性等问题迫使科学家寻找其他更合适的方法得到更符合病人需要的多能干细胞。在这种背景下，诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS 细胞）诞生了。它在应用潜能方面显示出无比优越性。本文就诱导性多能干细胞产生的历史、研究进展及应用前景做一综述。

1 iPS 细胞的产生方法

1.1 转基因技术

2006 年日本科学家 Takahashi 和Yamanaka[1]首次在Cell 杂志上报道通过逆转录病毒介导的转基因技术将 4 个转录因子即 Oct3/4、Sox2、c-Myc 及 Klf4 导入小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）获得一种多能干细胞，并命名为诱导性多能干细胞。随后，Takahashi等[2]和Yu 等[3]也分别获得人成纤维细胞（human fibroblast，HF）来源的 iPS 细胞。目前，可以从神经祖细胞[4]、肝细胞[5]、胃黏膜上皮细胞[5]、人精原干细胞[6]、头发角质细胞[7]中获得 iPS 细胞。这些初始细胞分别代表三个胚层来源的分化细胞，表明从不同组织来源的体细胞都能产生 iPS 细胞。这种现象并不限于某个胚层发育形成的组织[4]。最初的基因图谱分析显示 iPS 细胞基因组存在病毒插入位点[1]，但不明确这些插入位点是否是诱导所必需的。随后，利用不与宿主基因整合的腺病毒[8]、质粒[9]表达载体瞬时转染靶细胞也可以获得 iPS 细胞。这些研究尤其是后者更直接证明病毒基因插入突变不是诱导所必需的。由于质粒本身为异源性的 DNA，反复多次转染不能排除靶细胞基因组突变的可能，因此，无细胞毒副作用的小分子化合物似乎是更为安全的载体。Kim 等[10]使用一种融合了上述四种转录因子的细胞渗透蛋白（cell penetrating peptide，CPP）直接诱导 HF 细胞为 iPS 细胞。虽然利用腺病毒和质粒瞬时转染体系降低了插入致瘤突变的危险性，但是诱导效率极低。腺病毒也仍存在病毒的污染，目前尚未成功用于人的 iPS 细胞系的建立。

1.2 转基因剔除技术

虽然现在可以不使用病毒载体、c-Myc[11]就能获得 iPS细胞，但仍然需要 Oct4 或 Klf4。研究发现两者具有潜在的致细胞异常增生作用[12-13]，这种细胞用于临床治疗是不安全的。因此科学家尝试利用转基因剔除技术建立无外缘基因持续表达的 iPS 细胞系。Kaji 等[14]利用 c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2、2A 多肽的多蛋白质粒载体转染 MEF 细胞获得 iPS 细胞后进一步用表达 Cre-重组酶的瞬时转染体系剔除插入的外缘基因。另一种方法是利用 PB（PiggyBac）转座子——转座酶系统。PB 是来自飞蛾的一种常见转座子，可在人等哺乳动物的细胞株中高效导入基因并稳定表达[15]。Woltjen 等[16]和Yusa 等[17]两个独立研究小组分别利用 PB转座子将 c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2 四个基因导入 MEF、HF 细胞获得 iPS 细胞后通过表达转座酶将外缘性基因剔除，再进一步经过筛选获得转基因剔除的 iPS 细胞。基因图谱分析表明剔除后的基因组与原先未转染时的一致，未留下可发觉的痕迹。诱导效率为 0.1%～1%，与逆病毒一致，比腺病毒和质粒载体系统明显提高。但是这种系统也存在问题，验证基因组不存在外缘插入基因的过程十分繁琐，且已经发现在基因剔除后转座酶识别位点发生基因重排现象。

2 iPS 细胞的重编程机制

2.1 转录因子

c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2 是最常用的转录因子，都可以成功诱导鼠和人源性体细胞为 iPS 细胞。Nanog 和Lin-28是Yu等建立人源性 iPS 细胞使用的另外两个转录因子。Takahashi 和Yamanaka[1]认为 c-Myc、Klf4、Oct4 和Sox2 四个转录因子在诱导重编程方面起到重要作用，但并不是维持 iPS 增殖的必需因子，相反，这些因子的高水平表达不利维持 iPS 细胞的自我更新。Nakagawa 等[11]仅利用 Klf4 和Oct4 两种转录因子就能诱导神经祖细胞为多能干细胞，表明 c-Myc 不是细胞核重编程所必需的。后来Kim 等[18]仅使用 Oct4 一种转录因子也成功诱导神经祖细胞为 iPS 细胞，去除了具有致细胞异常增生作用的 c-Myc和Klf4。之所以有这种可能，是因为这些神经祖细胞比胚胎干细胞表达更高水平的内生 Sox2 和c-Myc，这说明具有适当匹配的转录因子的体细胞是生成 iPS 细胞的一个潜在有用的起始点。另外，表观遗传学发现 iPS 细胞基因组中那些位于开放结构状态的染色质上的基因对外源转录因子反应更敏感，而甲基化的基因反应迟缓[19]。与此研究发现一致的是，添加组蛋白去乙酰化抑制剂[20]、DNA 甲基化抑制剂[21]可以提高 iPS 细胞诱导效率。

2.2 插入突变

最初 Takahashi 和Yamanaka[1]发现每个 iPS 细胞克隆基因组中都含有大约 20 个病毒插入位点，因此猜测这些插入位点可能诱导某些基因表达的开启或关闭，这种插入突变可能是诱导所必需的。Aoi 等[5]也发现基因组确实存在病毒插入位点，但是在所获得的所有 iPS 细胞中插入位点并不完全一致。利用腺病毒和质粒载体瞬时转染系统更直接证明插入突变不是诱导所必需的。但是后者需要进行反复多次转染，所以也不能完全排除在诱导和重编程过程中基因组发生改变的可能性。

3 iPS 细胞的多向分化潜能

多向分化潜能是干细胞的一个特征，也是对 ES、iPS 等细胞进行干细胞特征鉴定的一个重要指标。目前鉴定细胞是否具有三胚层分化能力的方法主要通过体外培养形成拟胚体和免疫缺陷鼠体内接种形成畸胎瘤等方法[22]。实验证实目前建立的鼠源和人源 iPS 细胞都具有拟胚体和畸胎瘤形成能力。而且，和ES 细胞一样，在特定诱导条件下可以进一步分化为特定的细胞。至今，已经成功诱导 iPS 细胞分化为平滑肌细胞[23-24]、造血细胞[24-26]、血管内皮细胞[24-26]、淋巴管内皮细胞[25]、心肌细胞[24-25,27]、成骨细胞[28]、脂肪细胞[28-29]、树突细胞[30]、巨噬细胞[30]、运动神经元[31]、听觉螺旋神经元[32]。初始细胞不仅可以是正常的体细胞，还可以是遗传性基因组缺陷性细胞。将罹患 Fanconi 贫血病患者的 HF 细胞利用基因打靶技术纠正其异常核型后诱导为 iPS 细胞，并进一步分化为具有正常核型的髓系和红系造血主细胞[33]。这些自体来源的 iPS 细胞在自体干细胞移植方面显示出巨大的临床应用价值。

4 应用前景

4.1 建立疾病模型

Hanna等[34]将 iPS 细胞分化得到的造血祖细胞结合基因打靶技术移植入镰状细胞贫血模型的小鼠体内，纠正了异常镰形血红蛋白。至今已建立来自罹患遗传性疾病的病人 iPS 细胞[35]，包括腺苷脱氨酶-重症联合免疫缺陷病（ADA-SCID）、Shwachman-Bodian-Diamond 综合征、三型高雪病（gaucher disease type III）、进行性肌营养不良症（duchenne & becker muscular dystrophy）、帕金森病（Parkinson disease）、亨廷顿病（Huntington disease）、1 型糖尿病（Juvenile diabetes mellitus）、唐氏综合征（Down Syndrome）及 Lesch-Nyhan 综合征等。通过体外研究这些疾病特异性的 iPS 细胞，有助于间接推断疾病的发病机制及寻找有效的治疗措施。

4.2 研究人类发育生物学及新基因的发现

由于 ES 细胞来源的限制，人们对自生胚胎发育机制、增殖分化及调控、细胞识别诱导、组织及器官构建、畸变等问题尚未找到答案。而 iPS 细胞与 ES 细胞在生长条件、细胞表型、细胞的多能分化特性等许多方面有相似点，在一定程度上它可以代替 ES 细胞担任基础研究及临床应用角色。iPS 细胞体外自发分化的拟胚体可以模拟胚胎发育过程，可以作为组织、器官发生、发育研究的模型，弥补完整人胚不能用于这方面研究的缺陷。利用某些手段如转基因技术、体外导入报告标志基因、基因打靶技术、致畸试验、iPS细胞特化的细胞植入动物胚胎或成体动物中还可用于某一特定基因在形态及功能的整合等方面的研究。

4.3 自体干细胞移植

不依靠人工或捐献者的器官，凭借本人强大的自然治愈能力让丧失功能的器官再生是最理想的治疗方式。对于遗传性疾病，利用自体成体细胞建立 iPS 细胞，通过基因打靶技术纠正遗传性缺陷基因，再诱导分化为特化细胞进行移植。动物实验证明自体 iPS 细胞移植可以治疗镰状细胞贫血[33]、急性心肌缺血[36]。由于 iPS 细胞成瘤性问题尚未解决，目前还不能在人体开展临床试验，需要在动物实验中进一步积累 iPS 细胞移植治疗的经验。

4.4 新药发现及筛选

目前新药的药理、药代学、毒理学、药效学等细胞水平的研究及生物学模型，大都在其他种属的细胞系进行。然而异种细胞与人之间毕竟有不完全相同的药物反应。而患者及疾病特异性源性 iPS 细胞的建立可以实现在体外以人源细胞为对象的试验性用药，观察药物对其基因结构及表达的影响，间接判断该药物对某种疾病的疗效，这是一种全新探索及筛选药物治疗的模式。Yokoo 等[37]初步比较了不同的抗心律失常药对分别由 ES、iPS 细胞分化来的心肌细胞的收缩频率、强度的影响，发现两者无显著差别，且和临床经验用药的结果一致，表明经体外进行药物疗效的预实验，可筛选出针对个体有效的药物。这将对临床用药产生巨大的改革作用。

5 目前存在的问题及展望

5.1 重编程机制

如上所述，目前已经可以不用病毒介导转基因技术获得iPS 细胞，表明病毒插入突变不是必需的。对于转录因子，则意见不一。没有 c-Myc 参与或只用 Oct4 因子也可以获得 iPS 细胞[11,18]，但是其采用的初始细胞是已表达高水平某些转录因子的神经祖细胞，所以也不能完全排除对转录因子的依赖性。

5.2 诱导效率

此前报道 iPS 细胞诱导效率不到 0.1%[38]，效率太低阻碍了对重编程机制的研究，也阻碍了 iPS 细胞进一步发挥其应用价值，因此提高诱导效率的研究势在必行。添加SV40 大 T 抗原将转染效率提高了 23～70 倍[39]；添加强力霉素提高了至少 100 倍[40]。PB 转座子系统的转染效率与病毒系统无差异。Sall 4（Sal-like 4）也是胚胎干细胞相关转录单位之一[41]。添加转录因子Sall 4 比单用 Oct3/4、Sox2、Klf4 诱导效率提高了 10 倍。使用基因敲除技术敲除 Sall 4 后诱导效率显著降低[42]，但仍不明确 Sall 4 是否可被同组蛋白 Sall 1 或其他因子取代。降低培养环境的氧气溶度可以提高诱导效率，在 5% O2培养下效率可达0.40%，联合使用 I 型组蛋白去乙酰化酶抑制剂 Valproic Acid（VPA）效率可达 0.48%[43]，但何种氧气溶度以及在低氧环境下培养多长时间最为合适仍不明确。

5.3 致瘤性

iPS 细胞诱导过程中使用的转录因子 c-Myc 和Klf4都是癌基因，病毒插入也可以导致肿瘤发生，而且，未分化iPS 细胞自身尚可在体内形成畸胎瘤，因此，iPS 细胞的致瘤性是其进一步推广应用的一大障碍。虽然现在已经可以在没有 c-Myc、Klf4 和病毒情况下获得 iPS 细胞，而且随着细胞的分化，iPS 细胞形成畸胎瘤的能力也逐渐减弱，但关于如何在细胞移植前将混杂在其中的未分化 iPS 细胞去除[44]，以及在何分化阶段移植，目前还没有这方面安全应用的研究报道。

虽然 iPS 细胞距离临床应用还有一段时间，但伴随细胞生物学、分子生物学、发育生物学、功能基因组学以及转基因技术的进一步发展，iPS 技术必将在细胞移植治疗、药物筛选和发病机制研究中发挥重要作用。

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