牙周膜干细胞生物学研究新进展*

贺慧霞 刘洪臣

牙周膜干细胞(periodontal ligamentstem cell,PDLSC)是牙周组织再生最直接、最可靠的种子细胞，也是牙周缺损细胞治疗和基因治疗重要的细胞学基础，在牙周病治疗、种植体周围软硬组织缺损修复、正畸牙移动过程中的修复与改建中均发挥重要作用，是近年来牙周病研究领域的焦点和热点之一。其中关于 PDLSC的生物学作用、来源、组织学定位、分离方法、分化特性等方面研究都取得了可喜的新进展，为重新认识 PDLSC的生物学特性提供了依据。

1.PDLSC的生物学作用

PDLSC是指存在于牙周膜中具有自我更新和横向分化潜能的未分化的干细胞群，是由处于不同分化层次、具有不同分化潜能的祖细胞或前体细胞组成[1]。目前已证实 PDLSC能分化形成牙骨质、牙槽骨和牙周膜样组织，但对于牙周骨缺损修复细胞来自骨组织还是来自牙周膜一直存在不同意见。最近有学者[2]通过 PDLSC示踪发现：表达骨髓基质干细胞(bone marrow stem cell,BMSC)表面标志分子CD166、CD105的 PDLSC具有成骨潜能，当牙周损伤导致牙槽骨缺损后，这些 PDLSC迁移、分化为成骨细胞修复牙槽骨缺损，而牙周膜中不存在BMSCs。另有学者[3]将 PDLSC与生物支架材料羟基磷灰石-磷酸三钙(HA/TCP)复合，体内移植治疗小型猪牙周缺损，术后12周经细胞示踪和组织学观察，发现 PDLSC能显著提高新生牙周附着高度，这些研究表明 PDLSC是牙周损伤、缺损修复和再生的细胞学基础。牙周再生是极其复杂的生物学过程，而了解牙周发育学过程无疑对深入研究 PDLSC的生物学作用和实现真正意义上的生物再生都至关重要。最近有报道显示[4]：用发育中的根尖部牙胚条件培养基提供的生物学信号，可诱导 PDLSC向成牙骨质样细胞分化，形成牙骨质，这也说明牙周损伤修复与牙周发育可能具有相同的生物学过程[5]。另外，Ivanovski等[6]采用微阵列(microarray)技术，比较了再生组织来源的细 胞(regenerating-tissue derived cell， RTC)和牙周膜间充质细胞(periodontalligament mesenchymal cell,PLC)22000个基因表达，并进行功能分析，发现了两种细胞基因表达有显著差异，差异主要表现在与细胞来源相关的转录基因、与矿化组织形成相关基因、与牙周及颅面部发育及牙周再生修复中信号通路相关基因、及重要的生长因子、细胞因子基因。由此确定了参与牙周损伤修复过程中调控RTCs不同功能的多组基因。Liu等[7]也报道牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)和 PDLSC分别在牙本质、骨组织形成过程中CCND2、MME、DLL1等矿化相关基因表达上调，而KRT15等基因表达下调，这些基因相互作用是通过Notch、Wnt、FGF-β、BMP和Caderin等信号通路决定着干细胞的命运和组织再生。这些研究表明 PDLSC及其特异性基因在牙周损伤修复与再生中的重要作用，为揭示牙周损伤修复与再生的分子学机制奠定了基础。

2.PDLSC来源和组织学定位

关于 PDLSC的来源目前有两种观点。一种观点认为是牙周膜发育过程中原始牙囊组织中的未分化间充质细胞存留在牙周组织中形成 PDLSC，这些细胞来源于外胚间叶，正常情况下处于静息状态，当外界刺激信号到达干细胞局部微环境(niche)，干细胞按照预定程序增殖、分化、迁移修复受损组织。目前已经在人和大鼠牙周膜中发现了具有神经外胚层和中胚层分化潜能的多能干细胞[8,9]，这些细胞表达HNK/P75/nestin等神经外胚层及neurofilament M、β-tubulinⅢ等神经胶质细胞表面标志，并有少部分细胞表达肌纤维标志α-SMA，符合神经嵴来源细胞体外培养具有极强可塑性的特点[10]。尽管目前尚不清楚其来源与BMSC是否相似，但诸多研究都表明其具有间充质干细胞的特点，如克隆形成能力、增殖率高，表达间充质干细胞特异性表面标志分子STRO-1等[1,10]。另一种观点则认为 PDLSC来源于血运，定位在小血管周围。有学者将3H-胸腺嘧啶标记经静脉注入小鼠体内，分别在注射后1h到14d通过放射自显影技术观察磨牙牙周组织中标记细胞的数量和位置，发现在血管旁10μm范围内存在一标记细胞群，这些细胞较血管旁10μm以外区域增殖细胞细胞周期慢，大多数处于G0期，故认为它们可能就是牙周膜中的干细胞,这些细胞从牙槽骨的骨内膜间隙迁移至牙周膜及牙骨质表面,且毗邻骨内膜的牙周膜中的标记细胞高于骨内膜内的细胞达5倍以上，对应侧的牙骨质明显增厚，这些都表明干细胞随血运经骨内膜间隙定位于牙周膜内[11]。最近尚有研究报道： PDLSC表达血管周围细胞特异性标志分子CD146，共表达血管周围相关抗原3G5和α-SMA[10,12]，为 PDLSC来源于牙周膜小血管旁提供了新的证据。

Chen[13]等通过原位组织学和免疫组化学比较了健康牙周组织和炎症牙周组织中较为公认干细胞特异性标志蛋白STRO-1、CD146和CD44表达情况。发现对于健康牙，PDLSC分布在牙周近冠、近根尖区和根分叉区的牙根表面；而牙周病患牙近冠部牙周组织因炎症受损， PDLSC分布在其根分叉区和根尖区，且在血管周围0-20μm范围内，而且牙周病患牙的牙周膜中分布最多。此外，牙周病患牙的牙周膜血管外区域及靠近牙骨质部位，尚可见大量干细胞特异性蛋白染色阳性区域，而健康牙周组织中 PDLSC较少，分布在血管外区和近牙骨质部。出现这种现象的原因可能是病变早期，血管旁的 PDLSC对炎症刺激因子和细胞外基质的一种反应，PDLSC动员、募集并迁移到受损的牙周膜组织区，参与牙周膜损伤修复[1,14]。实际上，STRO-1、CD146染色阳性的血管旁细胞有两种不同的细胞表型：一种是内皮细胞，有扁平而长的胞核和胞浆，这两种抗体与血管壁的内皮细胞发生交叉反应导致其表达阳性[14]，而且血管旁干细胞和内皮细胞还表达其它间充质细胞标志如CD105、CD106和CD166。另一种则可能是干细胞，胞核深染，呈圆形或卵圆形，胞浆很少，形态酷似从牙髓和骨髓中分离的干细胞[15,16]。这表明：健康牙的牙周膜的干细胞可能位于牙周膜的小血管旁，而牙周炎患牙牙周膜干细胞位于血管旁及血管外及靠近受损组织部位；这些血管旁及血管外区域表达干细胞标志的细胞可能有一部分是血管内皮细胞，精确分离和鉴定这些干细胞尚需更特异的从DNA特征做更进一步界定。

3.PDLSC的分离、鉴定和分化潜能

从不同组织中分离成体干细胞目前尚无统一、理想的方法，一般主要是根据干细胞具有克隆形成能力的普遍特点和不同干细胞所特有的生物、物理学特性进行分离和鉴定的。 PDLSC由于尚无确定的特异性标志，目前主要采用STRO-1、CD146等公认的间充质干细胞标志蛋白经免疫磁珠或流式细胞分选法分离，这也是根据 PDLSC与BMSC、DPSC具有相似的组织结构和胚胎来源，沿用后两种干细胞的分离方法进行分离的[17]。同时，干细胞具有高度的克隆形成能力，可采用酶消化法原代培养 PDLSC，再用克隆分离法进行分离，这是最早分离研究DPSCs的方法。随着对 PDLSC研究的不断深入，关于 PDLSC表达STRO-1、CD146等间充质干细胞表面标志和某些血管周细胞表面标志CD105、CD106、CD166已达成共识，采用STRO-1抗体免疫磁珠分离或STRO-1抗体通过流式细胞分选是目前较为公认的有效分离方法[1,10,16,17]。最近，Gronthos[18]尚采用特异性间充质干细胞标志蛋白CD106通过免疫磁珠法从绵羊的牙周膜组织中成功分离 PDLSC。

成体干细胞的鉴定，目前普遍是根据的两大特点：自我更新能力和横向分化潜能来确定。在体外，干细胞的自我更新能力则表现为能形成细胞克隆的能力，酶消化的牙周膜细胞中有3.75-11.66%的细胞具有克隆形成能力。在体内将分离的PDLSC与生物支架材料HA/TCP复合后植入免疫缺陷裸鼠皮下，8周组织学观察可见 PDLSC分化形成包含牙骨质、牙槽骨和牙周膜结缔组织的全部牙周组织[12]。新形成组织还检测到牙周膜类似于腱组织的特异性转录因子—Scleraxis明显高于BMSC对照组形成的骨组织；此外，新形成组织还表达牙周膜相关蛋白-1(PLAP-1)和牙骨质特异性标志蛋白—牙骨质附着蛋白。这些都表明PDLSC体内移植后形成了真正意义上的牙周膜、牙骨质和骨组织，具有形成全部来源组织的自我更新能力[19,20]。

作为干细胞，PDLSC具有向其它类型组织细胞横向分化的潜能。在体外矿化诱导培养条件下，PDLSC能分化为成骨样细胞，形成钙化结节，碱性磷酸酶活性升高，表达成骨相关蛋白：骨钙素、骨涎蛋白、骨桥素、Ⅰ型胶原等[1,8,21]；在成脂培养条件下，PDLSC能向脂肪样细胞分化，形成油红特染的脂滴，并表达脂肪细胞特异性蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-γ)和低密度脂蛋白(LPL)[10,16,22]。 PDLSC在含一定浓度的二甲亚砜、丁羟回醚、福丝扣林、β-巯基乙醇和氢化可的松的联合诱导条件下可向神经细胞样分化，形成典型的树突状细胞，并表达神经元特异性烯醇化酶（NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等神经细胞表面标志[10，23]。最近，Gay等人用10ng/ml的转化生长因子β3(TGFβ3)诱导 PDLSC分化为软骨样细胞，并形成对甲苯胺蓝有异染性的软骨样基质，RT-PCR检测有Ⅱ型胶原的表达[24]。这些特点充分说明 PDLSC具有多向分化能力。

另外，细胞形态、超微结构及细胞动力学等生物学特性也是鉴定干细胞的重要方面。PDLSC具有与其它成体干细胞相似的生物物理学特点。PDLSC通常较周围成熟细胞或终末分化的细胞体积小，位于小血管周围，在形态上趋于未分化状态，圆形或卵圆、多角形，但在不同培养条件下有时有明显的形态学差异[12]。由于 PDLSC是由处于不同分化阶段异质型细胞构成，因此，在超微结构上部分细胞也具有未分化细胞的特点，如核浆比例较低，胞浆内细胞器较少等[21]。处于局部微环境中的 PDLSC多保持静止状态，细胞处于G0期。但当外界刺激信号引起干细胞原有的状态改变，则这些干细胞进入细胞周期，显示高度的增殖能力和分化能力。

值得思考的是日本学者Techawattanawisal等[25]最近采用神经球培养系统从成年大鼠牙周膜组织中成功分离了PDLSC。其依据是牙周膜组织是由颅面组织发育过程中的外胚间叶细胞发育而来，那么，出生后牙周膜中的干细胞应该具有神经嵴来源干细胞的特点，能够分化成神经和外胚间叶的子代组织如外周神经、神经胶质和骨骼肌。该系统已经成功用于骨髓、真皮和角膜等多种非神经组织干细胞的分离和培养，这种以基础培养基和生长因子为主要成分的无血清培养基能使干细胞在悬浮培养过程中增殖形成小球，而不同于传统细胞贴壁培养。结果显示PDLSC在悬浮培养中形成了类似于神经球的干细胞球，并表达神经嵴来源细胞的标志基因Twist,Slug,Sox2和Sox9，而且可以分化为神经元样、胶质样、少突胶质细胞样细胞和肌管，这与以前有关 PDLSC的报道截然不同，认为传统采用贴壁培养法所获得的PDLSC，其特性研究建立在多次传代的细胞基础上，其原始的生物学性状在传代中可能已经发生改变或因细胞不贴壁而被弃去。而此体系可保持原始干细胞的特征，有利于人们发现PDLSC完全不同于传统间充质干细胞的某些特性。最近有报道采用该体系从外周血中成功分离了非粘附性的成骨细胞，这也表明该方法的独特优势[26]。另有报道已经从真皮中分离出具有神经嵴来源干细胞特点的皮肤干细胞。这表明牙周膜中存在神经嵴来源的干细胞，采用此法所分离的 PDLSC具有神经嵴源性干细胞的特性，提示 PDLSC还将有可能在治疗肌萎缩等疾病方面发挥作用。

由此可见,对 PDLSC的生物学特性目前我们还知之很少，对 PDLSC还有许多未解之谜，诸如上述这两种完全不同的培养方法所分离的 PDLSC所表现出显著不同的生物学形状差异，是干细胞自然特性的不同表现形式，抑或不同体外培养条件导致 PDLSC内在特性的改变；这些差异的分子生物学基础及其特异性标志等，对这些问题的思考和解答必将推动对 PDLSC研究不断走向深入。

4.结语

PDLSC的发现是干细胞理论与相关技术发展的结果，也是牙周生理、病理学研究的一大飞跃。对 PDLSC生物学特性的研究是认识和应用PDLSC的必由之路。尽管目前对 PDLSC的研究才刚起步，许多方面仍有待于深入研究。但PDLSC在牙周生理功能维持、病理损伤修复中的重要作用及牙周再生方面潜在的巨大应用前景，为PDLSC生物学及其相关研究提供了新的契机。

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