食用菌多糖提取技术研究概况*

2010-02-09王雪冰赵天瑞

中国食用菌 2010年2期

王雪冰，赵天瑞，樊建

（昆明理工大学化学工程学院，云南昆明 650224）

食用菌多糖是由10个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物，存在于食用菌的菌丝体、子实体和发酵液中。食用菌多糖有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和抗感染活性[1]，同时还有增强免疫、抗氧化、降低血糖、抗溃疡、抗衰老、抗辐射等方面的生物活性和生理功能[2]。本文概述了几种提取食用菌多糖的方法，介绍其原理，通过比较近年来相关领域已有的研究报道，总结几种方法的优势与不足，为食用菌多糖的提取应用提供参考，并对食用菌多糖的开发利用做出了展望。

1 水提醇沉法提取食用菌多糖

多糖溶于水而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂。用热水进行提取，主要是借助于热力作用使食用菌细胞发生质壁分离，水作为溶剂渗入细胞壁和细胞质中，溶解液泡中的物质，使其穿过细胞壁，扩散到外部溶剂中。细胞内或细胞间物质的渗出主要靠扩散作用[3]。刘祖同、罗信昌归纳了食用菌子实体多糖的提取工艺步骤[4]：即食用菌子实体粉碎→脱脂肪→多糖的浸提→过滤（离心分离）→合并滤液→多糖沉淀→去蛋白质、脱色→多糖组分的分离纯化→多糖组成和结构的分析，其中，热水浸提的温度一般为90℃～100℃，浸提时间为1 h～3 h，浸提次数为2次～3次。

陈湘[5]利用水提醇沉法提取黄蘑粗多糖，结果显示提取的最佳条件为：料液比1∶20，提取温度90℃，提取时间3 h，多糖产率达21.32%。宁慧青[6]利用同样方法提取了灵芝、香菇、羊肚菌中多糖，所得多糖含量分别为4.875%、4.5%、8.1%，平均回收率为99.47%、99.18%、99.40%。说明此方法有较好的准确度。水提醇沉法的优点为试验设备简单，操作容易，准确度高，成本低廉，一次性投入较小，适用于大规模的工业生产，但提取效率低且费时，劳动强度大，产品纯化困难且活性损失较大，随着工业技术的发展，一些现代高新技术被应用于食用菌多糖的提取。也有利用索氏提取法提取食用菌多糖的报道，原理与水提法是相同的，即利用索氏提取器以水为介质对食用菌干燥粉末进行回流提取多糖。靳丹虹等[7]利用索氏提取法提取灵芝多糖，具体步骤为精密称取灵芝粉末6份各约2 g，分别置索氏提取器中，加水90 mL，加热回流提取6 h。多糖得率为0.512%。从此实验可以看出其用时较长，且多糖提取率并不高。利用此法的研究也较少。

2 酸碱浸提法提取食用菌多糖

原理是通过酸碱液的充分作用，使食用菌细胞、细胞壁充分吸水胀膨而破裂，从而使食用菌多糖充分游离出来，提高得率。田光辉等[8]以灵芝为材料考察了酸碱盐介质对灵芝多糖提取率的影响，结果显示提取温度为90℃，水提法所得多糖的质量分数为0.51%，1%Na2CO3溶液对多糖提取的质量分数为1.11%，0.5%HCl溶液对多糖提取的质量分数为0.89%。碱提法的多糖提取率最高。廖丽娟等[9]在对松茸多糖的提取试验中分别在90℃条件下，利用质量浓度为 30 g·L-1的 Na2CO3、 NaCl、 NaOH、 HCl溶液及蒸馏水提取松茸多糖，所测得松茸多糖质量分别为31.9 g·kg-1、 19.5 g·kg-1、 33.5 g·kg-1、 24.8 g·kg-1和 15.2 g·kg-1。与水提法相比酸碱法提取率明显提高。

由以上结果可以看出，酸碱介质能够明显提高多糖的提取率，但以酸作为介质时对糖苷键具有一定的破坏作用，降低多糖的得率，还会对容器造成腐蚀，除弱酸外一般不宜采用。采用稀碱液浸提后既能节省时间，又能减少原材料及试剂的消耗，且提取的多糖含量高，但碱提后的溶液浓度增大，造成过滤困难。

3 酶解法提取食用菌多糖

食用菌组成复杂，除多糖外还含有蛋白质、纤维素、半纤维素和果胶等物质，这些物质的存在会影响多糖的浸出，因此在多糖提取过程中适当加入酶制剂如水解纤维素的纤维素酶、水解果胶质的果胶酶等有利于多糖的浸出，在提高溶出效率的同时，为后续提取液的精制创造有利条件[10]。酶解法的一般方法为按一定料液比加入样品干粉和生物酶、蒸馏水，在合适温度和pH值下酶解一定时间，然后升温灭酶，在合适的温度下提取一定时间，离心取上清液，即可测定多糖含量[11]。以下分别介绍单一酶法和复合酶法在食用菌多糖提取中的应用。

3.1 单一酶法提取食用菌多糖

单一酶法是指只用一种酶来辅助提取食用菌多糖，从而提高多糖提取率。常用的酶有蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等。

蛋白酶可破坏蛋白质的肽键，水解细胞中的游离蛋白质，破坏其空间结构，使其变得松散。同时蛋白酶还可水解蛋白聚糖和糖蛋白中的蛋白质，降低其对多糖的结合率，使多糖更易浸出。刘青娥[11]在推荐的最佳提取条件下分别考察了果胶酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶对袖珍菇多糖提取效率的影响，以直接水提法为对照，结果显示木瓜蛋白酶酶解法有最佳提取效果，多糖提取率提高了95%。试验考察了酶解温度、酶用量、pH和酶解时间对木瓜蛋白酶法多糖得率的影响，得出的结果是酶解温度为50℃左右时多糖提取率最高，随着温度的升高,多糖提取率下降；木瓜蛋白酶用量为2.0%，因浓度增加到2.0%以后，再增加酶用量多糖提取率基本不再增加；最佳酶解pH值为5.2，因酶对pH值较为敏感，适当的pH值可维持酶活性中心的最佳空间构象，促进酶与底物的结合，提高反应速率；多糖得率随着酶解时间的延长而增加，超过100 min时有所下降，是由于酶解时间太长会引起糖结构变化甚至碳环裂解，致使多糖得率降低。

纤维素酶可使纤维素、半纤维素等物质降解，从而使细胞内的成分更易向提取介质扩散，食用菌多糖存在于子实体的细胞壁内，细胞壁的结构由纤维素维持，使用纤维素酶可水解细胞壁，提高多糖的浸出率。刘晓鹏等[12]利用纤维素酶辅助提取茶树菇多糖，比较了酶解法和水提法2种方法，水提法提取茶树菇多糖料液比为1∶60，提取时间120 min，温度为60℃时提取效果最佳，其多糖平均提取率为1.40%。纤维素酶酶解辅助提取茶树菇多糖的平均提取率为2.38%，比水提法提高了70.47%。纤维素酶酶解辅助提取茶树菇子实体多糖的料液比为1∶80，酶浓度1.5%，浸提液pH值为6.0，提取温度为50℃，提取时间为60 min，可以发现纤维素酶解法节省原料，缩短了提取时间，反应条件更为温和，提取率更高。而刘青娥[11]的酶法提取袖珍菇多糖试验中，纤维素酶酶解法较之水提法多糖提取率提高了42%。李洁等[10]以羊肚菌为实验材料研究了酶法提取的工艺条件，其中纤维素酶加量为15%，温度为45℃，提取时间为1 h时，其多糖浸提率为2.063%，优于水浸提法，同样条件的热水浸提法羊肚菌多糖得率仅为0.56%。使用纤维素酶提取食用菌多糖优于水提法，其条件温和，提取率高且不影响后续提取。

3.2 复合酶法提取食用菌多糖

复合酶法即使用2种以上的酶对多糖进行提取，多采用一定比例的蛋白酶、纤维素酶和果胶酶进行酶解。复合酶法的提取条件温和，提取率通常比单一酶法高，且杂质较易除去，能源消耗低。邹东恢等[13]利用木瓜蛋白酶、纤维素酶复合提取香菇多糖，其最佳工艺条件是：木瓜蛋白酶与纤维素酶质量比为2∶1，复合酶质量分数为0.4%，料液比为1∶20，酶解反应的温度55℃，pH值6.5，反应时间3 h，提取率可达16.1%。马淑凤等[14]利用二次回归正交旋转组合设计法，探寻复合酶法提取白灵菇菌丝体多糖的最佳工艺，复合酶系组成为纤维素酶、蜗牛酶、溶壁酶、中性蛋白酶，质量比为3∶2∶0.5∶5。试验结果表明当酶用量为2.53%、酶解温度39.6℃、酶解时间3.2 h、pH值7.2时，多糖得率最高可达8.23%，而水提法多糖得率为6.36%（由该实验室测得），高出1.87%。梁敏[15]采用木瓜蛋白酶、纤维素酶提取香菇多糖，加酶比例为2∶1（木瓜蛋白酶︰纤维素酶），酶解反应温度55℃，pH值6.5，反应时间3 h，多糖的提取率为16.1%，与传统水提法相比较，提取率提高了8.6%。可见，复合酶法处理可明显提高多糖的提取率。

酶法提取食用菌多糖经大量实验证明，可提高多糖的得率，且反应温度较低，提取时间较短；不足之处是酶的价格较高，又容易失活，实验过程中温度控制要求严格（因酶的最佳温度在很小的范围内，条件的改变可能导致酶的失活），且多糖的高级结构可能因酶的作用而改变[16]。

4 超声波法提取食用菌多糖

超声波法提取食用菌多糖是利用超声波的高频振荡、超声波的空化效应和机械剪切效应，通过强化固体微粒向液体的传质，促进提取剂向固·液界面扩散。另外，空化作用产生的冲击波和射流可破坏植物细胞壁和细胞膜结构，并除去部分妨碍酶与底物接触的物质，从而增加细胞内容物通过细胞膜的穿透能力。固体微粒和缔合水分子也被粉碎，变成微小的质团，从而提高了有效成分溶出的速度[17]，即可提高多糖的得率。王萍等[18]考察了超声波辅助法提取滑菇多糖的效果，寻找最佳的工艺条件，分别对液料比、超声处理时间、超声功率及水浴浸提时间4个因素进行了单因素和正交试验。具体操作步骤为称取预处理的滑菇干燥粉碎粉末，按一定料液比加蒸馏水，在0℃环境下进行超声波处理特定时间后，于80℃水浴锅中浸提特定时间，取出后离心，抽滤。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。通过正交试验得到超声波辅助法提取滑菇多糖最佳工艺条件为：料液比为22 mL·g-1，超声波时间40 min，超声波功率700 W，水提时间0.5 h。在此条件下滑菇多糖粗品得率达13.5%。而常规水浴浸提法提取滑菇多糖的提取时间长达6 h，且去蛋白后多糖得率也只为11.24%。超声波法提取时间短，提取效率高，并且提取过程可以在低温下进行，有效成分损失较传统方法小得多。但超声时间不宜过长，否则可能使多糖发生断裂而降低多糖的得率。

近年来，酶法结合超声波法提取食用菌多糖的方法也得到广泛应用。早年的研究报道认为，较高强度的超声波会致使酶失活[19]。但近年来的研究发现，适当强度的超声波不但不会使酶失活，还会增强酶的活性[20]。原因是超声波促进底物与酶催化部位的结合，同时促进产物进入介质，表现出酶催化活性的提高。其次，超声波空化作用产生的冲击波改变酶分子的构象，使其更易与底物结合，提高酶催化效率[21]。

廖伟玲等[22]采用纤维素酶协同超声波法提取香菇多糖，得到最佳提取工艺条件为：酶加量1.0%，料液比1∶15，超声功率为1500 W，超声时间为60 min。按此方法提取香菇样品中多糖，平均得率为6.64%。正交试验结果表明酶加量的改变对香菇多糖得率的影响最大。而在谢红旗等[23]的香菇多糖提取试验中，考察纤维素酶对香菇多糖的提取率的影响，加酶量为1%，单一使用纤维素酶的多糖提取率为5.50%，可见超声波辅助酶法较单一酶解法提取多糖有更好的效果。唐娟等[24]也利用超声波结合纤维素酶法对黑木耳多糖进行提取，通过单因素和正交试验得到，二者结合提取木耳多糖的最佳工艺条件为：超声波功率 40 W、pH值为 4.5、提取时间 2.5 h，提取温度为45℃，此实验纤维素酶的加量为300 IU·g-1。

5 微波法提取食用菌多糖

微波是频率介于300 MHz和300 GHz之间的电磁波，频率很高，能够透入物体的深处。Pare等[25]提出了微波提取的机理，即微波透过对微波透明的溶剂，到达物料内部的维管束和细胞内部，微波转化成分子的动能而发热，连续的高温使细胞内部压力超过其空间膨胀的能力，从而导致细胞破裂，胞内有效成分流出，从而容易进入提取溶剂。

靳丹虹等[7]分别利用索氏提取法、超声波法和微波法对灵芝多糖进行提取，索氏提取法多糖提取率为0.512%，超声波法多糖提取率是0.632%，提取时间比索氏法缩短9倍；微波法多糖提取率是0.868%，提取时间比索氏法缩短45倍。试验结果表明微波法提取率最高，且最为省时。么宏伟等[26]分别利用微波法和超声波法对松茸多糖进行提取，结果显示微波提取法更优于超声波法。正交试验表明超声波法的最佳提取条件为超声功率180 W，提取温度100℃，超声时间为13 min，料液比为1∶20，按此工艺进行提取，松茸多糖提取率为11.13%，纯度为90.28%。根据实验结果综合考虑，确定最佳微波提取条件为微波提取功率为660 W，微波提取时间为45 min，料液比为1∶25，按此工艺进行提取，松茸多糖提取率高达11.25%，纯度达90.74%。其中微波提取功率影响最大，其次是微波提取时间，料液比影响最小。由此可以看出微波法提取率更高，且多糖纯度也更高。何兵存等[27]通过正交试验寻找微波提取香菇多糖的最佳工艺条件为：料液比1∶25，浸提温度80℃，浸提时间3 h，微波辐射3 min，浸提1次。在此条件下，香菇多糖得率可达7.70%。李德海等[28]利用微波辅助法提取滑菇多糖，通过正交试验得到最优提取条件为以水为浸提剂，微波处理 4 min，液固比 28∶1（mL·g-1），微波功率为480 W，水浴浸提55 min。实验结果表明，滑菇粗多糖得率可达14.611%。而王萍等[18]利用超声波辅助法，最优条件下滑菇粗多糖的得率为13.5%，可见微波法多糖的提取率更高。

微波提取法的优点是简单、高效、节能、安全，具有高选择性，近年来广泛应用于生物活性成分的提取，如提取谷胱甘肽、黄酮类物质、多糖等生物活性成分。但微波法也有其缺点，此法耗电量较大，微波功率稍高，易出现焦糊状态，破坏食用菌多糖。

6 超临界流体萃取技术

超临界CO2流体萃取（SFE）分离过程是通过调节体系的压力和温度，来控制溶解度和蒸汽压2个参数进行分离，故超临界流体萃取综合了溶剂萃取和蒸馏的2种功能和特点。在特定条件下超临界流体选择性地把对应极性、沸点、摩尔质量的成分提取出来。对应范围内所得到的提取物不可能是目的物的纯净物，但可通过控制条件使目的提取物的含量有最佳比例。收集过程中，通过减压、升温的方法使超临界状态的CO2变成气体状态，目的提取物则被释放析出，从而达到分离提纯的目的。此法适用于热敏物质，且因黏度小、扩散系数大，提取速度较快[29]。

利用超临界CO2流体萃取技术提取多糖已有报道，赵子剑等[30]以茯苓多糖为评价指标，采用正交试验对超临界CO2流体萃取茯苓多糖提取工艺进行优选，得到最佳多糖提取条件为：萃取温度35℃，萃取压强20 MPa，夹带剂（水）用量0.4 mL·g-1，萃取4.0 h，在此条件下茯苓多糖的平均得率为5.276%。而杜玲玲等[31]利用微波法提取茯苓多糖，最佳工艺条件下多糖的平均得率为3.704%，可见此法提取率更优于微波法。王大为等[32]考察了超临界CO2流体萃取对蒙古口蘑多糖提取率的影响，采用超临界CO2流体萃取技术脱除蒙古口蘑中脂类及色素物质。经脱脂、脱色素后利用热水浸提法提取多糖，提取率为6.24%，是溶剂脱脂和色素前处理提取率结果的4.2倍，是未经前处理试样的1.8倍。

超临界流体萃取的优点为选择性好，适合分离热敏物质，溶剂回收简单，二氧化碳具惰性保护作用、无毒，萃取后无有害物质残留，可最大限度地保证产品的天然品质。其缺点为需在相当高的压力下操作，压缩设备投资以及附加费用较大，对配套设备要求很高，进一步提高了投资费用，且在连续化上还存在工艺设备方面的困难[33]。

7 展望

食用菌多糖的生物活性、食（药）用价值及无毒副作用的特性已被认可。我国是食用菌生产大国，据中国·牡丹江（东宁）第四届黑木耳节组委会发布的数据，2008年我国食用菌实现产值820亿，产量达1730万吨，占世界产量的80%以上。但我国食用菌主要以鲜品、干品、腌制、糖制或罐装的形式被消费，科技含量低，精深加工的比例小[34]。食用菌多糖的开发与利用还存在着一些问题，如研发力度不够，对食用菌多糖的高级结构、合成、药理学、临床学研究不够深入，产品科技含量低，为了使我国的食用菌多糖开发跟上世界的脚步必需加大对多糖科研的投入，才能使我国的食用菌多糖产品在国际市场上占有一席之地[35]；市场不规范，没有规范产品标准，因此应及时制定行业标准，形成规范的产业化经营模式，提升食用菌多糖行业的整体水平；关注度不够，应提升政府对科技含量高的企业的关注度，对进行食用菌多糖精深加工、活性成分合成的企业，相关制药企业等科技型企业进行政策和资金上帮助扶持，使其制造拥有自主知识产权的产品。我国是食用菌生产大国，食用菌多糖药品及保健品的研发已成为当前的研究热点，食用菌多糖无论在食品还是在医药领域都有巨大的开发空间。

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