蛋白酶体抑制剂 MG132对动脉粥样硬化的影响

肖 玲, 祝鸿雁, 王连堃, 郝爱萍

自从泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system,UPS)[1]被发现以来,其在科研领域里的成就取得了突飞猛进的进展,受到了极大的关注和重视,有研究显示 UPS可能在动脉粥样硬化形成中发挥一定的作用,但其具体机制尚不明确。本试验选用家兔高脂饮食加颈总动脉内皮球囊损伤术构建血管内皮损伤后动脉粥样硬化的动物模型,观察局部应用蛋白酶体抑制剂 MG132对家兔球囊拉伤后动脉粥样硬化的影响,初步探讨 UPS在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料 实验动物为体重 2～2.5kg左右的新西兰纯种大白兔,由哈尔滨医科大学动物部提供。术后高脂饲料(含 1%胆固醇、3%猪油和15%蛋黄)喂养。

1.2 实验分组 新西兰大白兔 30只,随机分成 3组。①高脂组(n=10);②MG132(1)组(n=10);③MG132(2)组(n=10),球囊拉伤颈总动脉,采用局部注射的方法在颈总动脉注入 1mmol/L MG132(蛋白酶体抑制剂)150μl,持续 5m in,PBS冲洗 2次。各组兔均以普通饮食 1周后加以高脂饲料(1%胆固醇、3%猪油和 15%蛋黄)喂养 8w。MG132(1)组术后血管局部即应用 MG132;MG132(2)组术后 4w局部应用 MG132。

1.3 颈总动脉球囊损伤模型的制备 普通饮食 1w后 ,行家兔颈总动脉球囊内皮剥脱术,逆行插入 4FPTCA球囊导管(导管直径 1.2mm,球囊膨胀直径 2.0mm,球囊长度 20mm)至颈总动脉段 40mm处,球囊内充以 0.5～0.7ml肝素生理盐水至 3个大气压,牵拉旋转导管,回抽球囊内液体,使压力降为零后重新注入导管,并牵拉旋转导管,重复上述过程共 3次,拔出球囊导管。于手术显微镜下缝合动脉切口,取下无创血管夹,可见颈总动脉有良好充盈。逐层缝合皮下组织及皮肤。术后切口局部给予硫酸庆大霉素 16万单位抗炎处理。

2 结 果

2.1 肉眼大体观察 高脂组兔的颈总动脉内膜增厚和管腔狭窄最明显,内膜面见浅黄色斑块样突起,大小不等,散在或融合成片,部分管腔几乎完全闭塞。MG132(1)组兔右颈总动脉血管组织结构基本正常;MG132(2)组兔的右颈总动脉管腔比较光滑,部分兔血管内膜有奶油样变化,颈总动脉内膜略有增厚,管腔也略有狭窄。

2.2 光镜下 HE染色观察 高脂组：兔右颈动脉内皮细胞脱落,可见粥样斑块,可见斑块“肩部”破裂,“纤维帽”断裂、斑块崩解,血栓与大的斑块相邻,斑块破裂及血栓处可见大量炎性细胞浸润。MG132(1)：组兔右颈动脉血管组织结构基本正常,管腔呈圆形,内膜、中膜和外膜分界清楚,管腔面由单层内皮细胞覆盖,内弹力膜完整,中膜层较厚,有8～12层环行排列的血管平滑肌细胞。MG132(2)：组偶可见少量脂质沉积。内膜向心性增厚、管腔狭窄,表面有纤维组织覆盖,形成典型的纤维帽。

3 讨 论

UPS是生物体内进行蛋白质选择性降解[2]的重要途径之一。研究表明 UPS通过调节细胞凋亡[3～5]进而调节动脉粥样硬化的发生发展。凋亡的细胞主要由巨噬细胞和平滑肌细胞组成。几乎所有的动脉粥样硬化均有细胞凋亡现象,这可能与内膜增生有关。一些短寿命的促凋亡蛋白 p53、Bax、p27在细胞内是通过 UPS降解的。对于处于活跃增殖期的细胞(如血管平滑肌细胞)UPS主要通过 NF-κB抑制细胞凋亡,从而抑制血管平滑肌细胞发生增殖性病变。Herrmann J[6]等研究中发现用高胆固醇饲料喂养的猪的动脉壁内的泛素聚合物和氧化应激的产物均明显高于正常组织,表明 UPS参与了动脉粥样硬化的形成。VersariD[7]等对颈动脉粥样硬化斑块的研究中发现,有症状患者的颈动脉粥样硬化斑块和增生的平滑肌细胞内泛素聚合物和氧化应激的表达均较无症状的患者高,表明 UPS在人的动脉粥样硬化行程中发挥重要作用。MG132是一种有效、可逆的醛基肽类性蛋白酶体抑制剂[8],能阻止 26S蛋白酶体对泛素结合蛋白的降解、抑制 20S蛋白酶体的糜凝乳蛋白酶活性,从而阻断泛素蛋白媒体通路。家兔高脂饮食结合动脉内皮剥脱术[9]能在短时间内造成血管动脉粥样硬化病变,它克服了单纯用高脂饮食复制模型所带来的时间长、效果不稳定、病变与人类动脉粥样硬化病变差异大和不易形成特定部位病变等特点。本实验复制的球囊损伤后血管动脉粥样硬化动物模型,其颈总动脉病变处管腔不规则,内膜向心性肥厚,管腔明显狭窄,甚至完全闭塞,平滑肌细胞自内膜下迁移并大量增殖。我们在球囊拉伤家兔颈总动脉内膜的基础上,同时局部应用蛋白酶体抑制剂 MG132后,较球囊损伤组明显减轻,这说明 MG132具有抗家兔颈总动脉球囊损伤后血管动脉粥样硬化的作用。在本实验 MG132(1)组我们发现大部分血管壁为正常结构,镜下无动脉粥样硬化表现,早期应用 MG132,由于抑制了细胞凋亡从而抑制了平滑肌细胞增殖,进而抑制了动脉粥样硬化的发生。

对于已经分化并且处于非分裂期的细胞如在不稳定的动脉粥样硬化斑块中的细胞 UPS还可聚集Ox-LDL或 LDL,诱导人单核细胞泛素耦联酶 E2-25k表达并泛素化细胞内蛋白,参与泡沫细胞形成动脉粥样硬化复合病变阶段,UPS参与辅助 T细胞活化。活化 T细胞释放 INF-r,减低动脉粥样硬化中细胞外基质蛋白合成,促使不稳定斑块破裂。在本实验MG132(2)组我们发现稳定性斑块居多,是由于我们在动脉粥样硬化发生以后应用 MG132,所以镜下可见大量动脉粥样硬化斑块,但仍以稳定性斑块为主,主要是由于高脂饲料加改良球囊内膜损伤造成动脉粥样硬化,而后应用 MG132抑制 UPS的活性,从而抑制斑块破裂。目前对泛素-蛋白酶体通路与动脉粥样硬化发生的关系尚处于探索阶段,蛋白酶体抑制剂的发现为研究 UPS在球囊损伤血管内膜后血管动脉粥样硬化的作用提供了直接有力的手段。可以推测 UPS在球囊损伤后血管狭窄和血管壁细胞凋亡过程中有重要作用,其中的机制有待进一步阐明。

综上所述,泛素蛋白酶体系统在动脉粥样化形成的不同阶段发挥不同的作用,随着其在医学科研领域里的广泛应用,人们已经逐渐提高了对它的认识。近 20年来该领域的研究已经取得很多令人鼓舞的成果和进展,部分成果已开始应用到临床疾病与肿瘤的预防和治疗上。但另一方面,仍有大量的问题和机制尚未清楚,有待进一步深入研究。

[1]Glickman MH,Ciechanover A.The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway：destruction for the sake of construction[J].Physiol Rev,2002,82(2)：373-428.

[2]Hershko A,Ciechanover A.The ubiquitin system[J].Annu Rev Biochem,1998,67：425-479.

[3]Chang YC,Lee YS,Tejima T,etal.mdm2 and bax,downstream mediators of the p53 response,are degraded by the ubiquitin-proteasome pathway[J].Cell Growth Differ,1998,9(1)：79-84.

[4]Monney L,Otter I,Oliver R,etal.Defects in theubiquitin pathway induce caspase-independent apoptosis blocked by Bc l-2[J].J Biol Chem,1998,273(11)：6121-6131.

[5]Lopes UG,Erhardt P,Yao R,etal.p53-dependent induction of apoptosisby proteasome inhibitors[J].J Biol Chem,1997,272(20)：12893-12896.

[6]Herrmann J,Gulati R,Napoli C,etal.Oxidative stress-related increase in ubiquitination in early coronary atherogenesis[J].FASEB J,2003,17(12)：1730-1732.

[7]Versari D,Herrmann J,Gossl M,etal.Qysregulation of the ubiquitinproteasome system in human carotid atherosclerosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26：2132-2139.

[8]刘俊文,杨向东,王 仁,等.蛋白酶体抑制剂 MG132诱导人巨噬细胞 THP21凋亡[J].中国动脉硬化杂志,2004,12(3)：271-274.

[9]管耘园,叶炳华,卢辉和,等.球囊损伤加高脂喂养建立兔颈动脉粥样硬化模型[J].实验动物科学,2007,24(1)：6-9.