二甲双胍对骨改建影响作用的研究进展*

冯 元 刘洪臣

二甲双胍是一种降低血糖水平而不增加胰岛素分泌的胰岛素增敏型药物[1]。其降糖机制主要是通过抑制葡萄糖生成与肝糖输出，抑制肠道对葡萄糖的吸收，且可使体重减轻，抑制脂肪组织分解，改善胰岛素抵抗[2]，增加周围血糖摄取，同时改善胰岛素分泌[2]。另外，英国前瞻性糖尿病研究(UKPDS)中发现二甲双胍可通过调节脂代谢，降低纤溶酶原激活物抑制剂 -1(plasminogenactivator inhibitor-1)的浓度和活性，减少血小板的聚集和黏附，增强血纤维蛋白溶酶原激活剂活性，内皮功能失调，从而减少发生血栓的倾向，降低了患心血管疾病的风险[2]。

最近，二甲双胍对由糖尿病引起的骨改建失衡的影响，引起了国内外研究学者的广泛关注。正常情况下，骨改建过程是由骨形成和骨吸收两部分组成；成骨细胞和破骨细胞分别为骨形成和骨吸收过程中的重要功能细胞。在细胞因子调控下，两者相互作用，使骨形成和骨吸收过程达到一种动态平衡。而在病理情况下，如糖尿病患者，其自身骨代谢发生紊乱，致使骨形成与骨吸收过程之间失衡，造成病理性牙槽骨吸收，颅面部发育异常等。目前，糖尿病患者的口腔健康问题越来越受到重视，本综述重点回顾近年来在二甲双胍对骨改建中功能细胞作用及其可能参与的相关信号传导通路的研究进展，对其在口腔临床中的相关性运用作以展望。

1.对成骨细胞的生物学作用

1.1 对正常血糖水平下成骨细胞的影响

成骨细胞是骨改建中的重要功能细胞之一。其在骨改建过程中参与胶原I型蛋白等细胞外基质的合成及矿化过程[3]。同时，成骨细胞与破骨细胞间相互接触，并通过分泌各种细胞因子，如白介素-6、NF-kB受体激活剂受体配体(RANKL)和前列腺素E2[4]，抑制破骨细胞分化，从而起到间接调节骨吸收的作用。

体外实验显示，二甲双胍在一定浓度下(200-1000μmol/L)呈剂量依赖性促进成骨细胞生长,但作用微弱。浓度为400μmol/L时,达到最大效应在24h和48h的细胞增殖率为非加药组的1.13倍和1.18倍[5];同时也证实二甲双胍可作为一种相对微弱的促有丝分裂剂刺激成骨样细胞UMR106和MC3T3-E1增殖，并呈剂量依赖性促进I型胶原合成；培养MC3T3-E1细胞三周后，二甲双胍可显著诱导其矿化结节的形成；结果提示，在正常血糖水平下，二甲双胍不仅可以刺激成骨细胞的生长和分化，而且还可促进细胞外基质的矿化[6]。另有研究显示[7]，二甲双胍可通过激活三磷酸腺苷活化蛋白酶(AMPK)，抑制成骨细胞分化过程中Runx2等关键基因的表达，从而影响成骨细胞的分化过程。结果提示，二甲双胍可通过不同作用方式对成骨细胞的生物学活性及功能产生影响。最近研究报道[8]，在牙周炎模型中二甲双胍可通过促进成骨细胞的矿化能力，有效地提高牙周组织的骨愈合能力。

国内研究人员报道，二甲双胍还能够显著增加下颌骨成骨细胞的葡萄糖摄取率,摄取的水平随着浓度的增加而增加。与此相应,二甲双胍同时也显著增强下颌骨成骨细胞的GLUT-1蛋白表达水平。GLUT-1蛋白表达水平与细胞的葡萄糖摄取率的一致,说明二甲双胍对下颌骨成骨细胞的葡萄糖摄取率的影响,可能是通过调节GLUT-1蛋白的表达实现的[9]。

1.2 对高糖环境下成骨细胞的影响

目前糖尿病病因尚不完全清楚。研究显示，糖尿病的病理变化如微血管病变、免疫低下、胶原分解等因素，可使软硬组织对局部致病因子的抵抗力下降，使种植体周围骨量减少、骨密度降低[10-12]。

体外实验显示，高糖环境下培养的成骨细胞骨钙素分泌水平下降，钙吸收延迟，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)，活性水平下降明显迟滞，矿化小结形态不规则和钙沉积异常，提示高糖环境可延迟成骨细胞的分化和矿化[5]。已证明二甲双胍除能有效的降低血糖，改善胰岛素抵抗之外，还可减轻种植体周围因为高血糖而发生的病理变化，增强种植体周围骨愈合能力[5]。另有研究显示，在高糖条件下，二甲双胍可促进成骨细胞的ALP活性，I型胶原基因表达，但抑制骨钙素的分泌、钙吸收、矿化小结的形成及钙沉积，结果提示在高糖条件下，二甲双胍也能促进成骨细胞的分化但抑制其矿化[10]。同时，研究人员还发现二甲双胍能有效抑制成骨细胞中半胱天冬酶-3活性、细胞凋亡和由晚期糖基化终末产物引起的胞内氧化应激的改变[13]。综上所述，二甲双胍对正常血糖水平和高糖环境下的骨代谢均可发挥一定的调节作用。

1.3 在成骨细胞中的转运

在药物转运实验中发现，二甲双胍顺浓度梯度跨膜转运的渗透系数Papp值随药物浓度增加而下降，说明二甲双胍跨成骨细胞转运不依赖化合物浓度；另外，在成骨细胞对二甲双胍摄取和转运的经时曲线上，随药物浓度增大，曲线线性部分的斜率变小，即转运速率在底物浓度低时增加快，随着底物浓度的升高，转运速率不再增加，表明二甲双胍在成骨细胞中的吸收和转运主要是由载体介导的协助扩散；此外，对温度敏感也是载体转运的共同特征；转运竞争抑制和非竞争抑制实验证明了介导转运的载体为Octs家族；RT-PCR、免疫组化和免疫蛋白印迹实验证明了这种载体为Oct1。而维拉帕米抑制实验表明，二甲双胍是通过P-gp蛋白转运至细胞外。实验结果证明成骨细胞具有转运二甲双胍的能力，且以Oct1转运载体为介导的协助扩散和P-gp介导的主动运输，为其临床运用提供了重要依据[14]。

2.对骨改建相关信号传导通路及因子的影响

2.1 MAPK信号传导通路

骨改建过程中的动态平衡是在细胞内、细胞外及细胞相互间的多种信号传导通路参与调节下完成的。MAPK信号传导通路被广泛认为参与调节多种转录因子活性，从而在细胞增殖、分化、凋亡过程中发挥作用[15]。研究已证实，多种影响骨细胞生物学活性的因素，如二磷酸盐、雌激素、甲状旁腺激素和应力刺激，其已明确的传导机制均与细胞外信号调节激酶-1/2(ERK-1/2)的磷酸化和细胞内重分配密切相关[16-18]。已有研究报道，应用二甲双胍治疗时，骨细胞中的ERK-1/2被磷酸化并呈现时间依从性；将二甲双胍加入体外培养成骨细胞的培养液中，15-30分钟后发现P-ERK胞核易位(nuclear translocation)并于90分钟后回于细胞质内[19]。目前认为MAPK信号通路对关键区域的作用及持续时间的正常调节是骨细胞增殖与分化过程中的重要环节之一。同时，MAPK信号通路还与雌激素对多种骨细胞凋亡的影响过程密切相关，已有报道，ERK磷酸化程度及聚集时间的长短是雌激素对骨细胞凋亡作用的基础[20]。由此可见，经由加入二甲双胍引起的ERK-1/2磷酸化和重置与促进成骨细胞的生长发育密切相关。

2.2 内皮型一氧化氮与诱导分化一氧化氮亚型(he enzymatic generation of NO by endothelial and inducible isoforms of NOS)

成骨细胞可产生一氧化氮(NO)，并使其参与到调节骨改建过程中[21]。已有研究显示，NO对成骨细胞具有双向作用[22];少量状态下的NO，可对成骨细胞的生长分化其正调节作用；而过量产生NO会导致对成骨细胞生物学活性的损伤。目前研究显示，二甲双胍可呈剂量依赖型增强成骨细胞中一氧化氮合酶亚型(iNOs)的表达，并在药物浓度达到100μM时，使iNOs表达最强；此实验结果与二甲双胍促进成骨细胞增殖的情况很接近，提示二甲双胍可能是通过影响NO的合成参与到成骨细胞生长发育过程中[23]。eNOs表达于成骨细胞中，实验证明，eNOs缺乏的小鼠骨形成显著减少[24]。因此，eNOs可通过调节成骨细胞功能在骨代谢中发挥重要作用。另外，骨形成蛋白家族(BMPs)主要负责于促进成骨细胞分化，这其中包括刺激骨结构蛋白Col-1和OCN的表达，以及骨基质的矿化[25]。已有研究证实，二甲双胍可以剂量和时间依赖型，显著激活AMPK通路，从而增强eNOs和BMP-2的表达；研究人员随后加入AMPK抑制剂Ara-A，发现二甲双胍对eNOs和BMP-2的作用受到了抑制。提示，二甲双胍可能激活AMPK信号通路，来刺激成骨细胞的分化和矿化过程[26]。

2.3 晚期糖基化终末产物(AGEs)-RAGE

已有研究证实，二甲双胍能抑制成骨细胞培养中由晚期糖基化终末产物(AGEs)引起的凋亡和坏死[27]。此结果与先前Cortizo[23]等人发现的当二甲双胍浓度达到500μM时，可在不引起成骨细胞死亡的情况下刺激细胞增殖的情况相一致。与此同时，研究人员还发现二甲双胍可抑制由AGEs引起的细胞内氧化应激的改变[27]。由此推断，二甲双胍可能阻断或抑制AGEs对骨细胞的作用。另有报道[28]，二甲双胍可抑制内皮细胞中AGEs受体RAGE的表达,而在成骨细胞中可上调RAGE的表达。研究人员推测，二甲双胍可能通过调节成骨细胞上AGEs受体RAGE的表达，来减少AGEs产生的毒性作用[29]。

3.对骨髓间充质干细胞分化作用的影响

老龄化引起的骨量减少总会同时伴随着骨髓脂肪组织的增加。正常的骨代谢中，骨形成和脂肪形成达到一种动态平衡，而两过程的平衡状态取决于骨髓间充质干细胞的趋向分化。

Cbfa1/Runx2已被证实是一组与成骨细胞分化相关的重要转录因子。其作用是调节多种负责成骨细胞活性的基因的表达。研究发现，二甲双胍可通过上调Cbfa1/Runx2的表达对成骨细胞分化产生正调节作用。

PPARg与C/EBPa是骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化过程中重要元素。两种因子的表达程度直接影响脂肪细胞的分化过程[30,31]。研究显示，将骨髓间充质干细胞分别向成骨细胞和脂肪细胞的培养，同时各加入100μM的二甲双胍。孵育21天后，发现骨髓间充质干细胞中成骨细胞标志性物质的mRNA表达增加而脂肪细胞的标志性物质mRNA表达减少；另外，二甲双胍显著刺激了矿化结节的形成且阻止了细胞质脂滴的形成；增强了Cbfa1的表达，且明显减少了PPARg的表达。由成骨细胞和脂肪细胞分化过程间的相互关系可以推测，二甲双胍可通过抑制PPARg的功能来调节成骨细胞和脂肪细胞的分化过程[32]。

4.研究展望

糖尿病可引起患者牙周病变及牙槽骨丧失，并对种植体骨结合造成一定影响。二甲双胍已在临床应用多年，其不仅能调整血糖水平，而且在大量的体外实验中已证实，其能通过影响成骨细胞的增殖和分化过程，改善因糖尿病引起的骨改建失衡。目前，二甲双胍对骨改建的影响机制尚不完全清楚，其也可能通过直接或间接影响破骨细胞分化成熟，或参与其它骨代谢相关重要信号通路，调节骨改建过程。综上所述，由于二甲双胍对成骨细胞的生物学作用，可将其考虑为种植体周围局部给药，以便减轻因糖尿病而引发的牙周病理变化，增强种植体周围骨愈合能力。然而，二甲双胍能否到达预期治疗效果，仍需进一步研究，结合体内与体外实验，为下一步研究糖尿病患者的牙种植治疗提供重要实验依据。

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