间充质干细胞治疗椎间盘退变性疾病的研究进展

朱伟荣综述 李春海，叶 伟审校

椎间盘退变性疾病（degenerative disc disease，DDD）是指由椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）引起的一系列疾病如腰椎间盘突出症、颈椎病、椎间盘源性疼痛、椎管狭窄症以及脊柱节段不稳等的总称。治疗DDD的传统方法包括保守治疗和手术治疗，可以在一定程度上缓解部分临床症状，但未能从根本上解决椎间盘本身的病变问题，切除椎间盘还可因脊柱不稳而导致退变的进一步恶化。近年来，随着组织工程学和细胞生物学的不断发展，退变椎间盘的生物学修复渐成脊柱外科的研究热点之一，人们可以通过生物学干预手段逆转或减缓椎间盘的退变以恢复其生物学功能，从而为DDD治疗问题的根本性解决带来了希望。

细胞治疗是治疗椎间盘退变性疾病极具潜力的生物学方法之一。椎间盘的种子细胞主要有纤维环内层细胞、纤维环与髓核移行区细胞、髓核内软骨样细胞、骨髓间充质干细胞（bone marrow mesen-chymal stem cells，BM-MSCs）、脂肪间充质干细胞（adipose mesenchymal stem cells，AMSCs）等。其中间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）来源丰富，具有很强的自我增殖和多向分化潜能，可分泌多种细胞因子和生长因子，且分化潜能相对有限，较之胚胎干细胞形成肿瘤的可能性更小，因此被认为是理想的骨组织工程种子细胞。但MSC的诱导分化是关键和难点，影响其分化的因素很多，如局部微环境的改变、其他相邻细胞的作用、细胞因子的刺激等。本文就近几年来MSC治疗椎间盘退变性疾病的相关研究进展进行综述。

1 BM-MSCs

BM-MSCs是一群存在于骨髓中的非造血干细胞，来源充足，取材方便，体外分离培养操作简单，细胞数量可通过培养获得大量扩增，免疫原性低，移植引起的排斥反应相对较轻，便于外源基因的转染和表达调控。自2003年Sakai等[1]首次将BM-MSCs作为椎间盘组织工程的种子细胞以来，众多学者对其在椎间盘退变性疾病的应用进行了大量基础研究。

1.1 BM-MSCs与椎间盘细胞或组织的共培养

诸多体外研究表明，BM-MSCs与椎间盘细胞的共培养可促进髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPC）增殖，提高Ⅱ型胶原和蛋白多糖的含量；培养方式、培养条件对这一过程产生重要影响。Tao等[2]对新西兰大白兔椎间盘NPC和BM-MSCs分别进行直接接触和非直接接触培养（即在NPC和BM-MSCs两种细胞之间隔一有小孔且允许可溶性因子通过的半透膜），发现直接接触培养方式中BM-MSCs呈环状聚集，且Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖（aggreacan）和sox-9基因表达明显增加，而非直接接触培养方式则无明显变化。Richardson等[3]用人NPC和BM-MSCs以不同比率分别进行直接接触和非直接接触培养，发现采用前种方式培养7 d后，BM-MSCs的Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、多（功）能（蛋白）聚糖和sox-9等髓核标志基因明显增加，且与细胞比率有关，当NPC与BM-MSCs之间的比率为75:25时增加最明显；但对于非接触培养系统而言，无论细胞比率如何变化，系统中以上髓核标志基因均无明显改变。Sobajima等[4]对人NPC和BM-MSCs在不同比率下共培养，当NPC与BM-MSCs之间比率为75:25和50:50时蛋白多糖和糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）等细胞外基质的合成最多。张福勇等[5]还报道了兔纤维环细胞和BM-MSCs共培养的初步研究结果，发现在离心管中三维培养条件下，兔纤维环细胞与BM-MSCs共培养能够促进增殖，增加Ⅱ型胶原和蛋白多糖的含量。

在近期的研究中，人们探讨了NPC和BM-MSCs之间相互作用的机制，如分化、刺激效果以及细胞融合等。Yang等[6]报道了非直接接触的BM-MSCs和NPC培养系统通过分泌可溶性因子对细胞增殖和基质成分表达所产生的影响，结果表明，与NPC共培养后BM-MSCs增殖呈上升趋势，Ⅰ型胶原和Fas伴随的死亡结构域蛋白表达显著下降，最初不表达的Ⅱ型胶原在共培养后开始表达；与少量BM-MSCs共培养后NPC增殖即显著上升，增加BM-MSCs的数量并不能进一步促进NPC的增殖，而聚集蛋白聚糖的表达随BM-MSCs数量的增加而增强。故其认为，BM-MSCs和NPC的相互作用可能是可溶性因子或直接接触交换细胞成分相互影响的结果。有研究认为细胞融合可能与成体干细胞可塑性以及其在组织工程中的潜能有关[7]，但Vadalà等[8]在允许各种细胞因子相互作用的三维共培养系统中发现，细胞融合与NPC、BM-MSCs相互作用下的BM-MSCs可塑性无关，同时发现NPC可诱导BM-MSCs的基因谱转向软骨形成的基因，提示BM-MSCs向软骨样细胞的分化。Umeda等[9]将大鼠NPC分别与BM-MSCs、全骨髓细胞（bone marrow cells，BMC）培养，结果显示，与BMC共培养时NPC增殖、基质合成、聚集蛋白聚糖mRNA表达、硫酸盐及脱氧胸腺嘧啶苷摄取均明显增加，提示BMC中包含了除BM-MSCs外的重要细胞，推测可能是造血干细胞。

Wei等[10]的报道揭示了大鼠BM-MSCs与大鼠完整椎间盘组织共培养的结果，培养后第14天、30天BM-MSCsⅡ型胶原、聚集蛋白聚糖和sox-9的表达上调，而这些改变在BM-MSCs单独培养时并未检测到，提示完整椎间盘可影响BM-MSCs的分化途径，由椎间盘中的细胞和细胞外基质的分子或信号提供的三维微环境可诱导BM-MSCs向软骨分化。

1.2 BM-MSCs的局部微环境

研究发现，BM-MSCs局部微环境的变化对BM-MSCs向椎间盘细胞的分化起到了至关重要的作用[11]。Wuertz等[12]从成熟和年幼的大鼠骨髓中分离出BM-MSCs并分别在低糖、高渗、酸性环境和三者的复合条件下单层培养2周，发现低糖环境可以刺激聚集蛋白聚糖、Ⅰ型胶原的表达以及细胞增殖，高渗和酸性条件下细胞增殖和基质蛋白的表达明显减少，三者复合条件下则表现为抑制作用，提示渗透压和pH值对BM-MSCs的影响较大。其后续研究进一步探讨了pH值对不同年龄大鼠BM-MSCs分化的影响，在pH值为7.4、7.1、6.8、6.5的条件下分别培养3～4周和4～5月龄SD大鼠BM-MSCs 5 d，结果显示，随着酸度的增加，两组均能下调聚集蛋白聚糖、Ⅰ型胶原蛋白以及金属蛋白酶组织抑制剂-3的表达，抑制细胞增殖，降低细胞活性，同时引起细胞形态的改变，但高龄组受酸度的影响相对较小[13]。Felka等[14]分别在有无IL-1β及是否低氧的四种胎牛血清中培养人BM-MSCs 28 d之后发现，无IL-1β低氧组形成的细胞微团最大，无IL-1β含氧量正常组次之，含IL-1β低氧组再次，含IL-1β含氧量正常组最小，蛋白多糖和Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白表达的信号强度亦出现类似的结果，提示IL-1β等炎性介质抑制了BM-MSCs向软骨的分化，而低氧条件有助于移植后BM-MSCs的软骨分化和表型稳定。

1.3 BM-MSCs与支架材料

理想的支架材料应具备生物相容性好、可降解、免疫原性低等特点，因此支架材料的选择是保证BM-MSCs移植效果的关键点。有学者研究了以端胶原、复合藻酸盐凝胶、多聚左旋乳酸等作为支架材料时移植的BM-MSCs对退变椎间盘的修复作用[1，15-16]。Crevensten 等[17]在退变的大鼠椎间盘中分别注入含或不含BM-MSCs的透明质烷凝胶，含BM-MSCs组凝胶注入后即在相应节段观察到荧光标记的BM-MSCs，第7天、14天仍可见BM-MSCs，但数量明显减少，第28天时恢复到最初的数量且细胞全部成活；其椎间盘高度与不含BM-MSCs组相比亦有增加的趋势，提示BM-MSCs可在椎间盘存活和增殖。Revell等[18]亦在吸取髓核后的猪椎间盘中分组注入透明质烷来源的多聚体代用材料HYAFF-R120和含自体BM-MSCs的HYADD-R3，6周后发现仅髓核吸取组正常椎间盘结构丧失（如纤维化、终板破裂等），而HYAFF-R120以及含自体BM-MSCs的HYADD-R3均可阻止这一改变，且形成了髓核样区域，它类似于正常椎间盘的双凸结构并含有活性软骨细胞形成基质。

1.4 BM-MSCs移植后的变化

近年来众多学者对不同动物实验模型中BM-MSCs移植后的变化以及对椎间盘退变的影响进行了探讨。Sobajima等[4]将同种异体BMMSCs移植到兔 L2/3、L3/4、L4/5椎间盘髓核，移植 24周后椎间盘组织切片中仍能观察到BM-MSCs，且未见受体动物发生系统性疾病，提示BM-MSCs在实验动物体内至少可存活24周；顾蕊等[19]采用显微注射方法将兔BM-MSCs注入兔腰椎间盘，术后60 d外源性BM-MSCs在活体兔椎间盘内仍处于存活状态；孙禹等[20]观察了移植BM-MSCs在兔椎间盘内的分化情况，发现在椎间盘环境的影响下，BM-MSCs可分化为软骨样细胞，从而为BMMSCs抑制椎间盘退变提供了证据。Jeong等[21]对雌性SD大鼠尾骨2/3、3/4、4/5节段进行放射学及组织学观察，结果显示，BM-MSCs移植组能够维持椎间高度，保持信号强度，移植后两周BMMSCs仍存活；而盐水注入组椎间高度逐渐丢失。

Hiyama等[22]对小猎犬椎间盘退变模型的实验结果表明，BM-MSCs移植可抑制蛋白聚糖和水含量的下降，进而抑制椎间盘退变并维持椎间盘的免疫豁免状态。研究还发现，移植前FasL仅在基因水平表达，移植8周后在髓核区域检测到FasL蛋白的表达，推测BM-MSCs移植可能通过BM-MSCs分化成可表达FasL的细胞来获得椎间盘免疫豁免状态的维持，故认为BM-MSCs移植可能直接引起退变椎间盘免疫豁免状态的恢复，亦可能间接通过刺激髓核细胞增加FasL的表达而获得免疫豁免状态的恢复。Wei等[23]将人骨髓干细胞移植到退变的大白鼠椎间盘中，42 d后在注入干细胞的椎间盘中仍可检测到用荧光标记的包括BM-MSCs在内的CD－细胞，且3周后分化成为具有软骨细胞表型（表达Ⅱ型胶原和Sox-9）的细胞，而荧光标记的CD+细胞21 d后就已无法检测到。此外，在未应用免疫抑制剂的情况下，髓核未见炎症细胞浸润且移植后宿主椎间盘细胞和注入的干细胞中FasL蛋白表达均上调。鲍军平等[24]评价了BM-MSCs在兔椎间盘退变早期植入椎间盘后细胞外基质的表达情况，结果显示，8周内实验组髓核蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量明显较模型组高，提示兔BM-MSCs移植可以延缓甚至阻止髓核退变，从而为青少年椎间盘突出症患者的临床治疗提供了新的思路。

2 AMSCs

脂肪来源的间充质细胞在体外条件下具有分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞等多种细胞类型的潜能。相较于BM-MSCs，AMSCs具有来源更为广泛、取材简单、获取过程损伤程度小、产率高等优势，因此在细胞治疗领域有着广泛的发展空间。

Li等[25]的研究表明，新西兰兔AMSCs在不同的分化条件下可向成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化；AMSCs与髓核共培养时Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的基因表达比藻酸盐单独培养或与纤维环共培养时增加2～3倍。Tapp等[26]还发现，沙鼠在三维培养条件下AMSCs受TGFβ刺激后可产生富含蛋白多糖和Ⅰ型胶原的细胞外基质，且蛋白多糖比AMSCs单独三维培养时增加48%；另外，AMSCs与人纤维环细胞共同在三维条件下培养时蛋白多糖含量比AMSCs与纤维环细胞单独三维培养时的总和还多20%。Lu等[27]将AMSCs和NPC共培养于仅允许可溶性小分子通过的非接触小室，结果发现，在微按摩法共培养条件下，Ⅱ型胶原、蛋白聚糖基因表达上调并伴骨桥蛋白、Ⅰ型胶原和过氧化物酶体增生物激活受体表达下调，提示NPC可通过分泌可溶性因子诱导AMSCs髓核样细胞表型分化；而在单层培养中，NPC迅速去分化，失去软骨样表型，Ⅰ型胶原表达增加。提示微按摩法培养的三维构型不仅对维持NPC的表型是必需的，而且对NPC的诱导分化性能也是必需的。此外，为研究Ⅱ型胶原和NPC在三维环境下对AMSCs的影响，Lu等[11]分别将AMSCs与Ⅰ型、Ⅱ型胶原单独培养和在Ⅰ型、Ⅱ型胶原、NPC中共培养（小室微按摩法），单独培养后第4天仅Ⅹ型胶原上调，未观察到其他软骨形成标记；在共培养条件下，与在Ⅰ型胶原中相比，AMSCs在Ⅱ型胶原中可观察到更显著的ⅡA、ⅡB胶原和蛋白聚糖基因上调，且在Ⅱ型胶原单独培养及与NPC共培养中均可见到细胞聚集，而后者细胞聚集时间显著延迟，认为可能与整联蛋白α2基因下调有关。

以上证据从不同角度关注了MSC修复退变椎间盘的研究，从而为DDD的治疗提供了新的方法。至于BM-MSCs和AMSCs谁更适合做软骨的种子细胞，有人认为BM-MSCs比AMSCs更具优势，亦有研究显示AMSCs和BM-MSCs在多向分化潜能上无明显差别[28,29]，这一问题有待进一步深入的探讨。

总而言之，尽管有关DDD的MSC细胞治疗已取得了可喜的进展，但该领域的研究仍停留在体外培养和动物实验阶段，有许多难题需要解决和面对，如：移植细胞的类型、细胞移植是否采用支架、细胞移植后的营养途径；椎间盘退变的确切机制、髓核细胞的表型或特征、老化或退变椎间盘的细胞和分子改变；应用细胞治疗的恰当时机和远期效果；控制增殖、避免形成肿瘤的方法等等。但随着研究的不断深入，相信在不久的将来，对DDD的细胞治疗及相关生物治疗会取得突破性进展。

1 Sakai D,Mochida J,Yamamoto Y,et al.Transplantation of mesenchymal stem cells embedded in Atelocollagen gel to the intervertebral disc:a potential therapeutic model for disc degeneration[J].Biomaterials,2003,24(20):3531-3541.

2 Tao F,Li F,Li G,et al.Differentiation of mesenchymal stem cells into nucleus pulposus cells in vitro[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2008,28(2):156-158.

3 Richardson SM,Walker RV,Parker S,et al.Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation[J].Stem Cells,2006,24(3):707-716.

4 Sobajima S,Vadala G,Shimer A,et al.Feasibility of a stem cell therapy for intervertebral disc degeneration[J].Spine J,2008,8(6):888-896.

5 张福勇,吴小涛,王运涛,等.兔纤维环细胞和骨髓间充质干细胞共培养的初步研究[J].东南大学学报(医学版),2008,27(3):195-198.

6 Yang SH,Wu CC,Shih TT,et al.In vitro study on interaction between human nucleus pulposus cells and mesenchymal stem cells through paracrine stimulation[J].Spine,2008,33(18):1951-1957.

7 Terada N,Hamazaki T,Oka M,et al.Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion[J].Nature,2002,416(6880):542-545.

8 Vadalà G,Studer RK,Sowa G,et al.Coculture of bone marrow mesenchymal stem cells and nucleus pulposus cells modulate gene expression profile without cell fusion[J].Spine,2008,33(8):870-876.

9 Umeda M,Kushida T,Sasai K,et al.Activation of rat nucleus pulposus cells by coculture with whole bone marrow cells collected by the perfusion method[J].J Orthop Res,2009,27(2):222-228

10 Wei A,Chung SA,Tao H,et al.Differentiation of rodent bone marrow mesenchymal stem cells into intervertebral disc-like cells following coculture with rat disc tissue[J].Tissue Eng Part A,2009,15(9):2581-2595.

11 Lu ZF,Zandieh Doulabi B,Wuisman PI,et al.Influence of collagen typeⅡand nucleus pulposus cells on aggregation and differentiation of adipose tissue-derived stem cells[J].J Cell Mol Med,2008,12(6B):2812-2822.

12 Wuertz K,Godburn K,Neidlinger-Wilke C,et al.Behavior of mesenchymal stem cells in the chemical microenvironment of the intervertebral disc[J].Spine,2008,33(17):1843-1849.

13 Wuertz K,Godburn K,Iatridis JC.MSC response to pH levels found in degenerating intervertebraldiscs [J].Biochem Biophys Res Commun,2009,379(4):824-829.

14 Felka T,Schǎfer R,Schewe B,et al.Hypoxia reduces the inhibitory effect of IL-1beta on chondrogenic differentiation of FCS-free expanded MSC[J].Osteoarthritis Cartilage,2009,17(10):1368-1376.

15 赵鑫,张海龙,黄师,等.骨髓间充质干细胞复合藻酸盐凝胶支架修复兔退变椎间盘的效果[J].上海医学,2008,31(8):562-565.

16 Richardson SM,Curran JM,Chen R,et al.The diferentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocyte-like cells on poly-L-lactic acid(PLLA)scaffolds[J].Biomaterials,2006,27(22):4069-4078.

17 Crevensten G,Walsh AJ,Ananthakrishnan D,et al.Intervertebral disc cell therapy for regeneration:mesenchymal stem cell implantation in rat intervertebral discs[J].Ann Biomed Eng,2004,32(3):430-434.

18 Revell PA,Damien E,Di Silvio L,et al.Tissue engineered intervertebral disc repair in the pig using injectable polymers[J].J Mater Sci Mater Med,2007,18(2):303-308.

19 顾蕊,陈伯华.外源性骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内存活状态观察[J].青岛大学医学院学报,2009,45(5):447-448,452.

20 孙禹,朱悦,夏茂盛,等.移植的骨髓间充质干细胞在兔腰间盘内分化的研究[J].中国医科大学学报,2008,37(6):748-749.

21 Jeong JH,Jin ES,Min JK,et al.Human mesenchymal stem cells implantation into the degenerated coccygeal disc of the rat[J].Cytotechnology,2009,59(1):55-64.

22 Hiyama A,Mochida J,Iwashina T,et al.Transplantation of mesenchymal stem cells in a canine disc degeneration model[J].J Orthop Res,2008,26(5):589-600.

23 Wei A,Tao H,Chung SA,et al.The fate of transplanted xenogeneic bone marrow-derived stem cells in rat intervertebral discs[J].J Orthop Res,2009,27(3):374-379.

24 鲍军平,吴小涛,王运涛,等.干细胞移植延缓椎间盘退变及磁共振示踪研究.东南大学学报(医学版),2008,27(3):166-170,封二.

25 Li X,Lee JP,Balian G,et al.Modulation of chondrocytic properties of fat-derived mesenchymal cells in co-cultures with nucleus pulposus[J].Connect Tissue Res,2005,46(2):75-82.

26 Tapp H,Deepe R,Ingram JA,etal.Adipose-derived mesenchymalstem cellsfrom thesand rat:transforming growth factor beta and 3D co-culture with human disc cells stimulate proteoglycan and collagen typeⅠrich extracellular matrix[J].Arthritis Res Ther,2008,10(4):R89.

27 Lu ZF,Zandieh Doulabi B,Wuisman PI,et al.Differentiation of adipose stem cells by nucleus pulposus cells:configuration effect[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,359(4):991-996.

28 Afizah H,Yang Z,Hui JHP,et al.A comparison between the chondrogenic potential of human bone marrow stem cells(BM-MSCs)and adipose-derived stem cells(ADSCs)taken from the same donors[J].Tissue Eng,2007,13(4):659-666.

29 Kern S,Eichler H,Stoeve J,et al.Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow,umbilical cord blood,or adipose tissue[J].Stem Cells,2006,24(5):1294-1301.