成肌细胞的临床应用进展

刘幸卉 廖 华

成肌细胞的临床应用进展

刘幸卉 廖 华

成肌细胞是指胞浆中含有肌丝的肌组织前体细胞，来源于中胚层干细胞，胚胎发育过程中首先由间充质细胞分化为成肌细胞，然后分裂、融合成多核肌纤维，形成肌小管，再进一步分化为成熟的骨骼肌细胞。成肌细胞具有自我更新和促进肌纤维再生的能力。成熟个体心肌组织与平滑肌组织均不含成肌细胞；骨骼肌组织中的成肌细胞是以肌卫星细胞形式存在，位于肌纤维基底膜与肌膜之间，相互间不融合，也不合成收缩蛋白，因环绕多核肌纤维而得名[1]。生理状态下，卫星细胞处于静止状态；在骨骼肌损伤及再生过程中，卫星细胞被激活，大量增殖、融合并分化，产生新生肌纤维。因此，成肌细胞在骨骼肌再生中是新生肌肉的细胞来源，起着关键作用。成肌细胞可以从肌组织中分离，可在体外条件下以克隆或混合培养、遗传工程的方法大量增殖，并回输至肌肉组织以治疗肌肉的损伤或缺损[2]。

目前，成肌细胞的临床应用已相当广泛，本文就成肌细胞移植在心血管系统及肌肉损伤治疗等方面的应用进展进行综述。

1 成肌细胞是广泛采用的基因治疗靶细胞

在临床和基础研究中,利用成肌细胞的生物学特性作为基因治疗的靶细胞有很多优点：①成肌细胞数量丰富，易获取，可通过注射进行大规模细胞移植；②目的基因产物（有活性的蛋白）可在成肌细胞中高水平表达，并可分泌到细胞外；③成肌细胞可与宿主肌肉细胞融合，形成多核肌细胞，并可在肌纤维中长期存活，有利于目的蛋白稳定、持续地表达；④骨骼肌是药物注射的常用组织，具有一定耐受性，肌肉组织血供丰富，表达产物易进入血液循环，到达靶器官发挥作用；⑤成肌细胞移植后不干扰邻近组织的正常生理功能，不需胶原包埋，肌肉组织易于重复活检，临床应用简便、安全[2]。Day等[3]以腺病毒为载体,将LacZ标志基因（B2半乳糖苷酶基因）转入永生化成肌细胞，注入兔膝关节后检测关节滑膜内目的基因的表达,6 d后在髌骨滑膜层见到大片表达目的基因的肌细胞以及有支架蛋白染色阳性的肌管和肌纤维，部分附着于髌韧带、交叉韧带止点及股骨髁间窝等处，7周后仍可见大量表达目的基因的细胞。Ye等[4]以聚乙烯亚胺纳米颗粒为载体，把人血管内皮生长因子-165基因转染自体骨骼肌成肌细胞，然后移植到急性心肌梗死大鼠心脏，4周后行分子学和组织学检查，与单纯注射DMEM和人骨骼肌成肌细胞组相比，转染组大鼠心脏血管密度显著增高，左心室前壁局域血流量也显著增加，说明基因转染成肌细胞治疗骨骼肌系统和心血管疾病是可行且高效的。

2 成肌细胞治疗心血管系统疾病

骨骼肌纤维与心肌细胞同为横纹肌，都起源于中胚层，分化过程有相似之处，经体外培养可得到大量可供移植的成肌干细胞。自体骨骼肌成肌细胞移植可避免免疫排斥反应，不存在医学伦理问题。骨骼肌成肌细胞植入体内后，可存活于缺血组织中，且不会无限增殖或形成肿瘤。将骨骼肌成肌细胞直接注入损伤心肌，能产生心肌细胞样的收缩与舒张。研究证明，成肌细胞可用于治疗缺血性心脏病，如心肌梗死和顽固性心力衰竭等。Tambara等[5]将新鲜分离的成肌细胞（未经培养扩增）植入梗死后的大鼠心肌，发现足量的成肌细胞移植后，能存活并定位于宿主受损心肌，分化成肌管，新生的肌组织占据了绝大多数心肌梗死区域，从而改善了心功能。另外，Gavira等[6]以猪为模型，研究成肌细胞在治疗慢性心梗方面的疗效，他们把20只猪分成4组，在6周内分别注射不同数量的骨骼肌成肌细胞，进行7个月的观察，发现实验组心脏功能明显好于对照组。3个剂量单位注射猪的左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）明显高于1个剂量单位注射猪。实验表明，尽管成肌细胞移植后出现心律失常，反复和/或大剂量注射成肌细胞于心肌受损部位，能显著改善宿主心功能，临床应用前景广阔。Murry等[7]观察到成肌细胞在植入成年大鼠缺血心肌2周后，表达慢收缩细胞的标志物肌球蛋白重链β（β-MHC），而不表达心肌细胞特异的标志物肌球蛋白重链α（α-MHC），并最终在心肌瘢痕内转变为抗疲劳的慢反应纤维，以适应心脏的生理功能。说明移植的成肌细胞并未分化成心肌细胞,而是分化为能负担心脏工作的慢收缩细胞。虽然无法证实成肌细胞可分化为心肌细胞，但以多种动物为研究对象、不同心梗模型（冷冻、动脉结扎及毒性药物）的多种试验，均可证明成肌细胞移植可使心功能得到改善。Taylor等[8]以羊为研究对象，用蛇毒注射至左室壁内形成心梗模型，3周后超声心动图检测其收缩功能；然后取自体骨骼肌成肌细胞移植，2个月后左室收缩功能证实较月前有所提高。Pouzet等[9]以小鼠为研究对象，在自体成肌细胞移植后2个月和1年时检测左室射血分数，证实两个时间点无明显差别，说明成肌细胞移植后对心功能的提供作用是长期的。

目前的临床试验并不支持成肌细胞移植对心梗的治疗效应。Philippe等[10]将心脏病患者随机分成低剂量组、高剂量组和安慰剂对照组。这些患者均有左心室功能障碍并伴有心肌梗死，具备冠状动脉手术指征。所有患者均接受了植入式心脏转复除颤器，97例接受成肌细胞注射（400或800万个；n=33和n=34）或安慰剂（n=30）。然而结果表明成肌细胞注射并没有改善心脏功能，可能是移植细胞因缺血、凋亡而导致移植失败。

骨骼肌成肌细胞是具有广阔应用前景的一种干细胞，也是修复心肌缺损时优先考虑的种子细胞。近年来，动物实验取得了一些令人鼓舞的成果，多数研究证明，植入细胞改善左室功能和逆转心室重塑，可能源于其在坏死心肌内形成了肌管。关于成肌细胞在心梗治疗的临床应用上，目前主要存在3个障碍：第一，移植后导致的心律失常；第二，植入细胞存活率低；第三，成肌细胞植入机体后存在变异性。虽然成肌细胞在体外易于培养和扩增，但体外扩增需要时间，因此对急性心肌梗死的患者来说使用自体成肌细胞移植目前仍不现实[11]。

尽管面临着诸多问题，但成肌细胞移植技术作为治疗心肌梗死的一种崭新手段，显示了其具有的治疗潜力。随着对分化调控、信号转导、归巢分子机制等研究的深入以及更多的大规模、临床随机双盲对照实验的开展，成肌细胞移植将为心肌梗死等疾病的治疗带来新的希望

3 成肌细胞治疗压力性尿失禁

尿道固有括约肌缺陷（Intrinsic sphincter deficiency，ISD）是导致女性压力性尿失禁（Stress urinary incontinence，SUI）的重要原因。目前对ISD导致的SUI尚无长期有效的治疗方法。由于ISD患者的尿道括约肌存在收缩功能障碍，进行肌肉干细胞移植可能是治疗SUI的最佳方法。其中成肌细胞具有增殖快、融合慢、多向分化潜能等特性，移植后存活率高，是一种理想的细胞移植物[12]。

Strasser等[13]选择42名女性和21名男性，接受经尿道超声引导自体成肌细胞和肌成纤维细胞的注射治疗，其中成肌纤维细胞注入尿道粘膜，成肌细胞注射入尿道横纹肌。把这些接受治疗的病人随机地分为两组。同时，7名男性和21名女性患者接受胶原注射治疗以作为对照组。经过12个月的随访，自体细胞注射治愈了39名女性和11名男性的尿失禁症状，生活质量评分从术前的51.38提高到术后的104.06。尿道横纹肌由术前的2.103 mm增厚到3.303 mm，并伴有收缩功能增强。术后的结果表明，在尿道横纹肌内有新的肌肉组织形成，但常规的胶原注射只治愈了2例患者。需要强调的是，超声引导在这种治疗中起着关键作用，传统的内镜操作不能够准确定位，因此影响自体细胞移植的治疗效果。男性和女性治疗结果的不同，在一定程度上是源于男性前列腺切除术后的影响。另外，这种治疗方法对放射治疗以及术后出现尿路瘢痕的患者无效。结果证实，成肌细胞移植可以用于治疗尿失禁，但远期效果尚有待更长时间的观察随访。理想的注射细胞数量和注射后对膀胱功能的远期影响也需要进一步研究。

4 成肌细胞治疗骨骼肌疾病

利用传统方法治疗骨骼肌严重损伤和许多遗传性肌病（如肌营养不良症等）效果不佳。作为肌肉前体细胞，成肌干细胞在骨骼、肌肉系统被广泛应用，可用于修复损伤的骨骼、关节和肌肉组织[14－15]。

成肌细胞是目前已知的哺乳动物体内唯一能大量分裂、增殖及迁移的肌组织前体细胞，具有与宿主肌纤维融合的能力，可作为有效载体广泛用于特定目的基因的转移，从而参与遗传性肌病的基因治疗。

成肌细胞移植较早用于某些遗传性肌病的基因治疗，如Duchenne肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）。Duchenne肌营养不良症是一种X-性连锁隐性遗传肌病，男性发病率为1/3 500，居神经遗传病之首。病因主要是X染色体短臂2区1带（Xp21）基因突变导致细胞膜骨架蛋白-抗肌萎缩蛋白（Dystrophin，Dys）缺乏所致，其病程进展快，预后差，目前临床尚无有效治疗方法[16]。细胞和基因工程治疗给DMD患者带来了希望，王训等[17]以Duchenne肌营养不良症模型－mdx鼠为模型进行成肌细胞移植，术后1个月、2个月、3个月分别取实验鼠的四肢骨骼肌，运用免疫荧光法检测抗肌萎缩蛋白的表达情况。结果表明，成肌细胞肌肉注射移植能够在一定程度上修复mdx鼠的萎缩肌组织，能否改善鼠的运动机能还需进一步研究。刘立斌等[18]以mdx小鼠为模型进行成肌细胞移植，术后4周采用一次性游泳力竭实验检测小鼠运动能力，取材行HE染色及5-BrdU、结蛋白、Dys免疫组织化学染色观察及图像分析。实验证实，移植的成肌细胞移植后，能在宿主体内存活并与宿主骨骼肌细胞融合，起到了一定的治疗作用。通过一次性游泳力竭实验证实，成肌细胞移植治疗后mdx小鼠的运动能力具有显著改善。作为治疗方法的一种，成肌细胞移植可以治疗DMD，但成肌细胞治疗存在融合性差及体内存活率低等问题，在将来的成肌细胞移植研究中，应该在基因修饰、趋化因子以及细胞间相互影响使之融合的技术等方面寻求突破，增加成肌细胞治疗的成功率。

在日常生活和体育锻炼中，肌肉损伤难免发生。肌肉一旦损伤，需要经历修复和再生过程。而成肌细胞对骨骼肌的修复和再生的发生、发展、转归的过程研究，对骨骼肌损伤后的治疗和康复治疗具有重要意义。Irintcher等[19]将培养的成肌细胞移植到冻伤骨骼肌中，可改善肌肉收缩功能。成肌细胞移植也被用于治疗肛门失禁，Ryoko等[20]利用差速贴壁分离法分别从1 d、1、2、3、4、8和12周的雌性小鼠获取成肌细胞，注射至大腿和肛提肌损伤的小鼠。免疫荧光检测证实，受损的下肢肌内出现新生的肌纤维，肛提肌内也出现融合肌管，成肌细胞移植为肛门直肠畸形修复手术后引起的大便失禁的治疗提供了新的思路。

随着对骨骼肌成肌细胞功能的深入了解和研究，会对成肌细胞在骨骼肌再生过程中的作用有更具体、准确的理解和认识，为骨骼肌损伤、遗传性骨骼肌疾病等提供更安全、高效的治疗方法。

5 成肌细胞临床应用的展望

随着细胞生物学、分子生物学技术的不断发展，成肌细胞移植技术日趋成熟。为许多利用传统方法治疗效果不理想的疾病，如心肌梗死、压力型尿失禁、DMD等提供了全新的治疗方法，但目前相当多的研究只限于动物模型，尚需进一步进行临床应用型研究。此外，细胞移植所引起的免疫反应、细胞融合率、长期的临床效果以及细胞移植所产生的并发症等都需要进行仔细观察和分析。我们相信，随着上述问题的解决，成肌细胞移植将在多种疾病的治疗上发挥重要作用，成为一种简便、安全、高效的治疗方法。

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Q813

B

1673－0364（2010）05－0295－03

2010年6月17日，

2010年7月30日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.05.017

国家自然科学基金项目(30771045)。

510515广东省广州市南方医科大学解剖学教研室。